旋毛虫种株基因组DNA多态性分析.pdfVIP

中文摘要 前靠 Owen 旋毛形线虫[Trichinella spiralis 简称旋毛虫]引起的旋毛虫病是一种人兽共患的寄生虫病，可在 人及150多种哺乳动物问广泛传播。近年来，我国部分省区的旋 毛虫感染有上升趋势，给人畜造成了严重危害。 ／有关旋毛虫种株的研究是进行各种深入研究的基本前提，一 直是旋毛虫的研究热点。长期以来国内外有关旋毛虫的种株分类 存在很大的争议。70年代以前，人们认为旋毛虫只有一个种：z nativa、T2)、We(z nelsoni、17)。而 pseudospiralis、T4)、The(r 随着分子生物学技术的发展，尤其是限制性片段长度多态性 株研究工作进展明显，多认同将旋毛虫属分为7个种：T1、他、 髓(Zbritovi、Tbr)、T4、T5(zmurrelli)、，17、Ⅱ0(z papuae)和 3个分类地位尚未确定的基因型：T6、髓、四。y 近年来，国内很多学者通过同工酶分析、等电聚焦技术、扩增 长度片断多态性(AFLP)和RFLP等研究，认为我国的猪体与犬体 旋毛虫间存在明显差异，属于两个不同的种，因此，我国至少存在 两种旋毛虫；但也有人持不同意见，认为二者间的亲缘关系较近， 属同一种群。另外，在旋毛虫种株的分类与地理分布的关系等方 面也存在着不同见地。 多态性检测技术。它是利用碱基顺序随机排列的寡核苷酸(通常 为10聚体)为引物，对目的基因组DNA进行PCR随机扩增，由于 物种的不同，其基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和 数目都有可能不同，所以扩增产物的大小和数量也不同，通过对扩 增产物的琼脂糖凝胶电泳可以获得详细而精确的DNA指纹图谱， 再根据扩增产物的带型及强弱即可分析不同种株间的某些区域乃 至整个基因组DNA的差异性。要想了解基因组更多的遗传信息， 则需用尽可能多的引物进行随机扩增，这是RAPD技术的一个重 要特点。目前，国内应用RAPD技术进行旋毛虫研究的报道有3 篇，尽管应用的引物量不是很多(分别为1、1、5条)，但为旋毛虫 种株研究奠定了良好的开端。 本实验采用较多的新的随机引物(包括单一引物和复合引 物)，扩大被检测的基因组的范围，力求获得更多新的遗传信息， 进一步对国内、外的旋毛虫种株间差异及虫种归属进行探讨，确定 宿主种类、地理分布对种株的影响。另外，进一步通过聚类分析确 定各种株之间的亲缘关系，以了解它们在进化过程中的分化情况， 为旋毛虫种株进一步的基因型鉴定和分类积累有意义的资料，同 时本实验也为旋毛虫病的检测、诊断及流行病研究提供了理论依 据。 ／ f实验方法 ，，，一- 采用8组单一引物和12组复合引物分别对我国三株旋毛虫 (黑龙江五常犬、黑龙江海伦猪及河南新野猪)和两个国际标准虫 种[T1(波兰家猪)、，12(挪威北极熊)]的基因组DNA进行随机扩 增，扩增产物经1．2％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，在GDS8000 ID 凝胶分析仪上照相。根据分子量标记的迁移率，应用Gelworks 技术现行的统计方法进行数据分析，根据Nei’s等的公式：SI= ·2· 2N。。／(N。+N。)计算出随机扩增多态性DNA片段的共享度(也称 遗传相似指数)。根据遗传相似指数，用SPSSl0．0统计分析软件 对各种株间的亲缘关系进行聚类分析。 实验结果 1．单一引物对旋毛虫基因组DNA扩增反应的结果： 增中产生稳定的扩增带型，共得到5组清晰且重复性较好的DNA 指纹图谱。 引物P一01、P一03、P一04、P一06既得到了犬株与猪株旋毛 虫的种间共有片段，又