核苷酸切除修复基因XPB反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步分析.pdfVIP

兰兰壁垄茎竺旦茎堡堂堕翌兰望垡望生兰咝 核苷酸切除修复基因XPB反义RNA表达质粒的构建 及其功能的初步研究 摘要 癌的死亡率极高，除了外界致癌物质的作用，个体对致突变及致癌物质反 蔑毖传多态性是决定肺癌易感性的重要因素之一。过去对参与致癌物质激活和 转化的基因已经有了非常深入的研究，现在认为，一系列参与DNA损伤识别和修 复的基因在决定肿瘤易感性方面亦发挥了重要作用。 DNA自身内部结构的改变(如脱氨基作用和去嘌呤作用等)和外界化学毒物， 发射性物质等对DNA的损伤均能破坏细胞基因组稳定性和整体性，并由此引发细 胞死亡、组织退化、衰老和癌症。因此识别并修复各种DNA损伤对于生命的延续 非常重要。针对不同类型的DNA损伤，细胞有相应的修复系统来传递损伤信号，／， 执行修复功能，如核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复和重组修复等。， 核苷酸切除修复作为细胞内重要的DNA修复系统，可以修复由太阳光中短波 长紫外线引起的DNA损伤，众多化学物质引起的大片段DNA加合物以及一些氧 化性损伤等。整个NER修复系统至少包括30种蛋白，主要有XPA—G、RPA等， 任何一种NER蛋白功能的缺失会引起稀少的常染色体隐形疾病着色性干皮病、科 H 凯恩综合征、毛发硫营养障碍症等。作为NER的核心因子之一和通用转录因子II 的p89亚单位，着色性干皮病B基因在NER和转录起始中表现出ATP依赖的 3’．5懈旋酶活性，是NER解旋阶段必不可少的NER因子。 另外DNA损伤修复系统在保护正常组织免受基因毒性物质影响的同时，也 可引起肿瘤对化疗药物的获得性耐药。肿瘤细胞的耐药常伴随DNA损伤修复基因 表达增强，采取反义策略降低细胞的DNA损伤修复能力可以增加肿瘤细胞的药 物敏感性。因此探讨XPB基因对细胞DNA损伤修复能力及抗肿瘤药物耐药性 的影响非常有意义。 摘要／Abstract 华中科技大学鞠济医学院 硬士研究生学博论文 在本磺究中，我们拟构建出能在哺乳动物细胞中淡达XPB反义RNA的表达 质粒pcDNA-XPB／AS，在此基础上进一步磺究XPB基因功8§裙其对德疗蘩物敏感 性的影响。 cDNA 《第一部分我镅采耀RT-PCR技零扩增XPB5’端一羧69—520殛魏j挚列， 并将熟反向插入表达质粒pcDNA3．1／His中。酶切图谱分析和麟因测序证实反义表 达矮靛peDNA-XPBIAS褥建成珐； mRNA表达永平。DNA琼脂耱凝胶电泳分祈转染薪 blot努摄转染髓居缬藏XPB 后细胞DNA损伤情况。单缁臌凝胶魄泳比较煨铂诱导的转染麓后缡熙DNA损伤 及修爱情况。MTT法检测转染前艏细胞对顺铂药物敏感褴差异。RT-PCR和 Northern blot分橱显示转染细腿XPBmRNA表达水平下降。DNA璩￡鹭糖凝驳魄溶 分析鼹示转染细胞DNA损伤程度较舛乏转染细胞重。以10．0¨g／ml顺铂诱导细胞 DNA损霞，SCGE显示转染缨麓较束转染缅藏DNA损伤程度翱羹虽修复速度变慢， DNA损伤修复能力明鼹下降。MqT法显示出转染细胞对顺铂药敏感性增高。 mRNA表 庋义表达艨粒pcDNA-XPB／AS构建或凌，其髭下调转染缁藏XPB 达，抑制细胞DNA损伤修复能力，增加细胞对化疗药物敏感性，为进一步研究 XPB揍困葫麓 奠定了纂穑7、p 、 荧键词： 名蔷爵雨最赫P 韵强迂鏖堕墅型窑弦B弋核苷酸切除修毵反义黼巾NA 按伤修 物敏感牲 持要／Abstract 2 兰生壁堇茎兰旦茎堡堂壁 塑兰笪堑兰堂丝!全盘