根霉脂肪酶催化降解天然高分子壳聚糖分析.pdfVIP

根霉脂肪酶催化降解天然高分子壳聚糖研究 摘要 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，来源十分广泛。低分子量的水溶性壳聚糖 delemar菌)脂肪 具有独特的生理活性和药用价值。本文利用微生物(Rhizopus 酶催化降解天然高分子壳聚糖制备低分子量壳聚糖，对脂肪酶的生产条件、脂肪 酶降解壳聚糖的条件及降解产物的分离与鉴定等进行研究。具体研究内容如下： 、生物固态发酵法生产脂肪酶 ， delemar菌，以固态培养方式生产脂 f利用实验室筛选的一株野生型Rhizopus 、一． 肪酶酶制剂。研究了发酵条件中的碳源、氮源、培养基含水量、温度及接种量等 因素对脂肪酶产量的影响。结果表明，以农副产品黄豆饼粉为基础培养基添加淀 粉为碳源、蛋白胨为氮源有利于R．delemar菌的生长及脂肪酶的合成。培养基 的含水量及培养温度对根霉菌产酶有显著影响。在优化条件下，即129豆饼粉中 肪酶的产量最高活力达320IU／g干培养基。以蒸馏水浸提培养基，得粗酶液，经 ． 、／ 等电点沉淀、凝胶层析分离及冷冻干燥，得纯酶粉，活力为24301U／g。Y 二、脂肪酶催化降解壳聚糖的条件优化 J ／研究了反应体系的温度、pH值、底物浓度、酶量、反应时间及常见金属离 子昝因素对酶解反应的影响。结果表明，反应体系的温度对酶解的影响很大。脂 肪酶催化降解壳聚糖的适宜温度范围是40。C～50。C，以45。C为最佳，而对温度高 于或小于此温度时，壳聚糖的降解速率均呈下降趋势，45。C时的反应速率大约是 20。C时速率的5倍。反应体系的pH值也对酶解反应产生很大影响，当溶液的pH 值在4．5～5．5之间时，脂肪酶降解壳聚糖作用明显，以pH5．0为最适pH。在实验 酶量范围内，酶量的增加使酶解反应速率加快，二者之间几乎里线性关系，方程 为y=3．86x．0．16。适当增加底物浓度，也使酶解反应加快，但从两者的双倒数图 可见，R．delemar菌脂肪酶催化降解壳聚糖的反应不符合简单的一级应动力型模 使壳聚糖发生絮凝，无法反应；Ni2+、C一会使脂肪酶活力下降，是酶制剂；而 Na+、◇、Fe3+、鹾f+等囊予基本不影稠鼗薅酶对亵聚糖豹降熬。在侥毒{二抟爱藏 条件下，壳聚糖溶液的粘度随反应时间呈现出先快速下降后慢速下降趋势，在嫩 初的1h内，粘度下降至原溶液粘度的36％，6h时，粘度为原液的8％。另外， 越不羁残压酸熬轰聚糖终鼷疆究表明，克聚耱黢乙酸疫豹提毫煮枣J子降簿速率瓣 撕陕。y 三、固定化脂肪酶的制各及降解壳聚糖试验 f l戮零隽素微粒秀载豁、瘦二醛爻交联裁，采嚣l啜瓣与交联糖络合豹方法鲤 定化脂肪酶。对固定化反应的条件进行了优化，得到的最佳反应条件为：酶粉与 应温凌和霹翊分爨兔豹℃驺馥。露l怨豹强定毒乏l鬟虢貉茨活力隽40iu／g。 以制备的固定化脂肪酶作降解壳聚糖试验，并以相同酶活的游离酶作对照， 结果表明，固定化酶同样能催化降解巍聚糖。在相同的反应条件下，反应8h降 瓣产蘩懿乎均聚会褒霾定纯簿3。s，瑟游离簿秀3．4。鼹霆定纯酶瓣经嗣稳定镶遵 行试验，在相同的反应体系和反应条件下，反复回收使用同一份阉定化酶，作降 解试验。结果显示，随糟固定化酶重复使用次数的增加，其活力照下降趋势，每 ， 镬焉一次缳弦效率乎均下海7％，重复缓羯至9次辩，健铯效率终为琢素熬一拳。尹 四、降解产物的分离提纯及鉴定 f在优化的条件下，以脂肪酶催化降解壳聚糖，跟踪测定降解产物的平均聚 ≮ 合度，～同辩麓高羧滚攘惫灌(珏Pl￡)分援检验。蹲簇芨应缝寒嚣，经过滤、浓缨， 用Sephadex凝胶柱层析分离，分部收集沈脱液，用DNS比色法跟踪测定还原糖 浓度，并用HPLC对收熊液进行纯度捻验，以此判断降解产4勃∞分离情况。合并 缝分褶同懿浚集滚，浓缭干燥嚣，徽绞终光谱分褥签定。y ’、 …一凇‘；蟹指i生物毹壳聚“焚 低分子量轰聚耱声L Studiesonthe