监测海水有机磷农药的生物传感器研制——敏感酶的筛选、纯化与固定技术分析.pdfVIP

监测海水有机磷农药的生物传感器研制 ——敏感酶的筛选、纯化与固定技术研究 捅 妥 、Ik形成威胁。为了控制海水有机磷农药的污染程度，减少渔业损失，我国现行的 《海水水质标准(GB l 3097．1997)))和《渔业水质标准(GB ’5拉硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药的浓度作了严格限定。然而，仅有标准还不 足以有效控制有机磷农药的污染水平，重要的是对有机磷农药进行快速灵敏的监 测。近年来，人们更多地把注意力集中到具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定 。PI-、低成奉、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测的生物传感器上。 小念r#删学研究表明，有机磷农药的毒性作用主要归因于对动物乙酰胆碱酯 酶[acetylcholinesterase，AChE(EC 性变化与有机磷农药的浓度存在良好的相关性。这正是制作AChE酶传感器监测 有机磷农药的理论基础。此外，已经知道不同生物来源的AChE对有机磷农药具 仃4i旧的敏感性，因此，为了灵敏监测海水中微量有机磷农药，有必要对不同生 物来源的AChE进行筛选。鱼类被认为是水生生态系统中对有机磷农药较为敏感 的。类动物。目前，已有许多报道采用鱼脑AChE作为检测水体有机磷农药污染 程度的指示酶。同时，鉴于海水高豁度的特性，生物传感器应以海洋动物的AChE 为酶源。所以，本文以10种海洋鱼类：鲈鱼(Lateolabrax (Hexagrammos otakii，)、美国红鱼(Sciaenops major)、 黑鲷(Spar“s macrocephalus)、鲅鱼[Scomberomorus u et 【Navodonseptentrionalis(G nther)】、鳗鲡口nguilla Schlegel)】、黑头鱼【Sebastodes u 真鲥黑鲷、黑头鱼、鳗鲡美国红鱼、黄花鱼、面包鱼。对甲基对硫磷，由Ic50 有机磷农药都较为敏感。另外，鱼脑AChE活力的抑制作用与水体中的有机磷农 药具有良好的剂量一效应关系。在l～50mg·L。。浓度范围内，两者问呈现较好的线 农药的线性响应程度，黄鱼和鲈鱼脑AChE分别适于作为监测马拉硫磷和甲基对 硫磷的指示酶，而鲅鱼脑AChE对两种有机磷农药都适用。 在筛选得到敏感酶的基础上，采用亲和层析法对鲅鱼脑组织的AChE进行分 离纯化．然后对其进行底物特异性、过量底物抑制效应和抑制剂选择性检验。结 kt 果证实该酶为AChE，其最大比活力为297．82 7O～8 泳纯。在海水背景下，进一步探讨了纯化酶(游离状念)指示海水中有机磷农药 微污染的可行性。实验表明，在抑制时间为20rain时，马拉硫磷和甲基对硫磷对 鲅mJ】I；}lAChE的半抑制浓度分别为1．26×10～mol·L‘1(4．154 tool·一(1．168 mg·一)。鲅鱼脑组织的AChE列马拉硫磷和甲基对硫磷均较为敏感。 实验还发现，在～定浓度范围内，AChE活力对有机磷农药表现出显著的线性响 应。这提示，鲅鱼脑组织的AChE可以作为监测海水有机磷农药酶传感器的敏感 捌料。 捌街酶传感器的关键技术是酶的固定化，它影响到酶活性的保持和传感器的 制备固定化的鲅鱼脑组织AChE。酶活力测试发现，该固定化酶具有很高的催化 活力和较好的稳定性，酶活回收率达88％。pH稳定性和热稳定性的研究结果表明， 经过固定后，酶的最佳pH值范围变化不大，但其最适温度范围变宽，热稳定性提 高。以该固定化酶为识别元件，以pH电极为换能器，构建流动注射型乙酰胆碱酯 u 4．29×10～mo[．L‘’(或0．1 g．L-