野生型MEF细胞与缺失PLC-γ1基因的MEF细胞总蛋白质表达谱差异的分析.pdfVIP

摘 要 PLC—y1在细胞的生长与分化、生物体的发育、细胞转化以及 l发挥上述作用的机制 氧化应激中发挥着重要的作用。鉴于PLC—y 尚未完全阐明，PLC-Yl通路与其他信号通路间的交联和代偿尚无 系统报道，又因为以往的研究方法不够全面，本研究以野生型小鼠 胚胎成纤维细胞(PLC—Y1”)和缺失磷脂酶C—Y1的小鼠胚胎成纤 维细胞(PLC-71斗)为研究模型，在众多蛋白组学策略中选择了双 向电泳+质谱(2．DE+MS)作为研究手段，通过对比表皮生长因子 (EGF)刺激24小时后上述两种细胞的总蛋白质表达差异，全面地 探讨敲除PLC一,／-1对生长因子诱导的信号传递的影响，从而间接研 究PLC—Y 1生物学作用、信号传递机制及其代偿情况，为后续的深 入研究打下基础。 本研究首先优化了总蛋白抽提方法，构建了清晰的、高分辨率 的合成图谱(C伽P0sITEMAP)，摸索了适合本细胞株的蛋白质染色 方法，其低背景、高灵敏度及与质谱兼容的特性是后续的肽指纹图 谱(PMF)分析的前提条件。 在完成对实验方法的优化后，以EGF刺激24小时后野生型MEF 的双向电泳图谱作为对照，与敲除PLC-v1基因的MEF细胞的双向 电泳图谱进行比较，共进行了3次重复实验，获得较好的重复性和 可比性。凝胶图象经MELANIE3．02软件分析表明：野生型MEF 组和敲除型MEF组约有1450+100个蛋白质斑点可被检测；以匹配 斑点的校正光密度值(％v01)进行相关性统计，野生型MEF组的组 内相关系数为0．858、O．867、O．875，而敲除型MEF组的组内相关系 数为O．842、0．846、O．863。经过软件分析和手工修正，挑取了7个 在两组凝胶中不能匹配的蛋白质斑点(一组存在而另一组消失)，目 前已对其中3个进行了质谱鉴定，其中一个确切鉴定为vimentin，而 另外两个不能得到鉴定。Vimentin是一种第三类中间纤维，与c-fos、 e-jun和CREB具有较高的同源性，在细胞分裂时常常大量地重新组 织，发生显著的磷酸化。Vimentin还常常调节蛋白的转位和信号的 传递。实验结果显示：经过EGF刺激24小时后，相对于野生型MEF 组，敲除型MEF组的2-DE图谱中代表Vimentin的蛋白斑点消失， 暗示缺失PLC-3,1基因可能直接或间接导致了Vimentin的不表达， 与其他信号通路的交叉点，尚需结合其他方法进行深入研究。 下一步的研究将继续深入探讨Vimentin与PLC．y1通路的关系， 2一DE 同时使用合成双向电泳图谱(CoMPOSITEMAP)以比较生长因 子刺激后PLC—Y l“+与PLC．31+的总蛋白表达差异，力求发现更多的 表达差异的信号分子。随后辅以其他手段如酵母双杂交、免疫印迹、 免疫共沉淀等更为深入地研究这些信号分子与PLC-Y1的相互调节 机制。 关键词：磷脂酶c—y1，蛋白组学，双向电泳，信号转导 Abstract is known an C-Y 11 to I(PLC—V widely phopholipase play role in ceU and important regulating proliferation ofthe transformationand organisms，cell differentiation，development oxidativestress．Till mechanism