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植物细胞融合技术 什么是植物细胞融合技术 植物细胞融合是指用酶脱除细胞壁的方法将不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株的生物技术。 １９６０年英国生物学家科金发明了用酶脱除细胞壁的方法，给植物细胞融合技术扫清了第一道障碍。在许多研究人员成功地进行了不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株后，许多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植物。１９７８年，德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交后代———薯番茄。他们先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高ｐＨ溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达４０％～５０％。他们也曾进行过有性杂交的实验，但都失败了。 植物细胞融合技术的理论基础 1,细胞全能性 2,细胞膜的流动性 植物细胞融合的步骤 一 原生质体的制备 原生质体的分离 在分离之前要对实验材料进行消毒处理 原生质体分离方法 原生质体的纯化 活力测定 可以根据原生质体的形态来判断 可以根据细胞原生质体的环流速度或是颗粒状内含物布朗运动快慢判断（由悬浮细胞或是愈伤组织来源） 可以用0.1%酚番红或是伊文斯兰染色来检测原生质体活力 二 植物细胞融合 采用PEG法和电融合法比较适用 PEG原理 减少细胞间的游离水，促使 细胞靠近并破坏细胞磷脂双分子层，改变膜结构，细胞相互接触并容易结合在一起 电融合原理 高压电导致细胞产生可融合的穿孔 融合的方式 三 植物融合子的鉴定 融合的原生质群体中异核体一般只占0.5%-10%并且随培养时间延长会进一步减少。 最简单的是根基双亲细胞的形态差异识别杂种细胞 比较常用的还有适用某些可见的生化标志，如亲本对外源激素的要求不同 还可以利用营养缺陷型突变细胞系互补进行选择分离杂种原生质体，对融合产物进行鉴别 若融合子不存在可见的标志可以将原生质体分别用不同的荧光染料进行标记，后通过荧光显微镜镜检识别异核体。 植物细胞融合新进展 * * 原生质体的制备 植物细胞融合 植物细胞融合子的鉴定 原生质体的分离 原生质体的纯化 原生质体的鉴定 原生质体活力的测定 悬浮培养细胞无需消毒 较脏的外植体 外植体 指植物组织培养中的各种接种材料。 清水清洗 再以肥皂水 清洗2到3遍 浸入70%酒精 消毒 3%氯化钠 处理 无菌水漂 洗数次后 无菌滤纸吸干 原生质体分离方法 机械分离：借助利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使 原生质体分离 酶分离：把原料放入能降解细胞壁的混合等渗酶溶液中 保温一段时间细胞壁在酶作用下被降解 获得大量有活力的原生质体 按照分离原理进行分类 常用细胞壁降解酶类；纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，R-10，蜗牛酶 什么时候 停止酶解呢？ 纯化方法 过滤离心法 40-400微米网 筛过滤细胞混合液 除去未消化的 细胞细胞团碎片 适当溶剂低速离心 使原生质体下沉于管底部 如此反复收集3-4次 漂浮法 原生质体密度较小 能在具有一定渗透压溶液中 漂浮，然后可用吸管收集 沉降法与漂浮法结合 收集到的原生质体酶解液 低速离心倾去上清液 沉降得到的原生质体 重新悬浮于洗涤液中离心 收集沉于底部的原生质体 重复两次以上操作 *