mir-193b通过负向调控mct7抑制u251细胞的迁移与侵袭.docVIP

doi: 10.6043/j.issn.0438-0479.201608009 (miR-193b通过负向调控MCT7抑制U251细胞的迁移与侵袭 王占祥* 摘要：探讨miR-193b对人胶质瘤细胞系U251迁移、侵袭能力的影响利用HiPerFect Transfection Reagent瞬时转染miR-193b模拟物（minics）及阴性对照（miR-negative control）来上调U251细胞中miR-193b的表达，通过real-time PCR）检测其转染效率，然后进行细胞划痕实验及侵袭实验，分别检测miR-193b对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。应用生物学信息软件预测miR-193b的靶基因，采用荧光素酶报告基因系统验证miR-193b调控的直接靶基因，并利用real-time PCR及Western blot）分别在mRNA和蛋白水平上对靶基因进行验证。结果：过表达miR-193b可抑制U251细胞迁移和侵袭的能力(0.05)；生物学信息软件预测提示MCT7可能是miR-193b的潜在靶基因构建双荧光素酶报告基因从转录水平证明MCT7为miR-193b的直接调控靶基因real-time PCR及Western blot分别在mRNA和蛋白水平上进一步证明MCT7基因受miR-193b的调控，是其调控的靶基因。miR-193b可以通过负向调控MCT7基因的表达来抑制U251胶质瘤细胞的迁移及侵袭。 关键词胶质瘤miR-193b；MCT7；迁移侵袭 中图分类号 R730.264 文献标志码 A 胶质瘤发生于神经上皮，是发病率、致残率、术后复发率和死亡率最高的颅内肿瘤，成人发病率为6/10万，5年存活率20%～30%[1-2]。手术治疗是胶质瘤最直接、最基本的治疗方法，也是胶质瘤的首选治疗，但由于胶质瘤呈浸润性生长且和周围正常脑组织没有明显界限，故手术难以完全切除，且容易复发，其中患有高度恶性的多形性胶质母细胞瘤的患者中位生存期仍然少于15个月[3]。为了攻克胶质瘤的治疗这一世界性难题，同时为了延长胶质瘤病人的生存期，一些创新的治疗技术如光动力学治疗、免疫治疗、基因治疗等不断应用于胶质瘤的治疗中，并取得了一定的疗效。随着对胶质瘤发病机制的不断深入探索，大量研究证实miRNA与胶质瘤的发展紧密联系，但关于miR-193b在胶质瘤上的研究相相对较少。通过研究miR-193b在人胶质瘤细胞迁移、侵袭中的作用机制，将为临床提供新的胶质瘤的诊断标志物和特异性治疗靶点。 材料和方法 主要材料 细胞株（WHO分级为Ⅳ级）为厦门大学附属第一医院中心实验室冻存。DMEMHyclone公司，miR-193b mimics和miR-193b mimics NC由上海吉玛制药技术有限公司合成，miR-193b特异性引物购自北京天根生化科技有限公司（引物序列为5’-AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU-3’）特异性引物U6和GAPDH的特异性扩增引物购自上海生工生物工程股份有限公司HiPerFect Transfection Reagent、miRNeasy Mini Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit均购自德国QIAGEN公司，Transwell小室BD公司GAPDH、MCT7兔抗人单克隆抗体abcam公司，羊抗兔二抗Santa Cruz公司，双荧光素酶报告基因试剂盒Dual-Luciferase? Reporter Assay System）购自美国Promega公司。 方法 细胞培养和转染 胶质瘤U251细胞用含10%胎牛血清青霉素及链霉素μg/mL的DMEM培养液，置于37 ℃、CO体积分数为5%培养箱中培养，更换培养液，消化传代。处于对数生长期的细胞并计数，调整细胞密度2×105/孔）接种于6孔板中，换为不含抗生素的DMEM培养液（含10%胎牛血清）继续培养24 h，待细胞融合率达70%~80%时，按HiPerFect Transfection Reagent转染试剂盒说明书进行操作。培养68 h后可将培养液换成含有10%血清的完全培养液，继续常规培养672 h后，根据实验的需要进行相关细胞功能学检测。 检测转染后U251细胞中miR-193b和MCT7的表达 收集转染24 h后的细胞，按miRNeasy mini Kit提取试剂盒说明书的操作步骤提取miRNA；根据miScript II RT Kit试剂盒说明书的操作步骤合成cDNA；并应用miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒在LightCycler480 PCR仪上进行目的片段的扩增检测。扩增条件：95 15 min预变性，94 15 s变性、55 30 s退火、7