乙型肝炎病毒表面抗原基因.pdfVIP

遗 传 学 报， 10(4);254-260,1983 ActaGeneticaSinica 乙型肝炎病毒表面抗原基因 在大肠杆菌中的表达’‘ 敖世洲 高美华 周0钟 潘铁城 丁红珍 李载平 （中国科学院上海生物化学研究所） 通过次级克隆我们组建了乳糖操纵子启动基因控制下的乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 基因片段和乙型肝炎病毒 (HBV)基因组两种表达质粒，能在大肠杆菌中合成 卜半乳糖昔酶－ 乙型肝炎病毒表面抗原杂合蛋白，可被放射免疫分析和蛋白凝胶电泳所检测。 乙型肝炎病毒 (HBV）引起的乙型肝炎是世界各国流行的传染病2[51，对人类的危害 极大。从带病毒的血清中分离乙型肝炎病毒表面抗原 H（BsAg)，作为血清疫苗对乙型 肝炎的预防有明显效果。4,14,101。但带病毒血源有限，耗费很大，在实际应用上有不少困难。 DNA重组技术发展起来以后，利用基因工程方法在细菌中生产乙型肝炎疫苗的研究引起 了广泛重视。几种亚型的HBVDNA 已经克隆成功5,‘6,11]2HBsAg基因在细菌中的表达 也有报道[7［,10,181。我们用 HBV基因组和 HBsAg基因片段，经过次级克隆，组建了两种表 达质粒，在乳糖操纵子 l（ac）启动基因控制下，大肠杆菌合成了户半乳糖昔酶 妞-gal)- HBsAg杂合蛋白，能被放射免疫分析和蛋白凝胶电泳检测。 利用这一系统可以研究 HBs勺 基因在大肠杆菌中的表达规律，探索细菌生产乙型肝炎疫苗的途径。 材 料 和 方 法 一（）DNA 的分离纯化 HBVDNA来自ayw亚型HBVDNA克隆株PCP10 法（国巴斯德研究所Tiollais 教授赠给）。质粒pBR322,pMG401,pCP10及其他重组质粒按前文方法制备[Y10 二（）酶制剂及其反应条件 限制性内切酶BamHI,EcoRI,BgIII,HindIII,Xhol及T4DNA连接酶由本室工 具酶组提供。S1核酸酶等 BRL产品。限制性内切酶及 T4DNA连接酶反应条件见前 文2【10 S1酶反应条件为：250mMNaCl,30mMNaAc,pH4.5,4.5mM ZnS04,24Fzg DNA,500-1000单位 S1酶，反应体积 50pl,37℃ 作用60分钟0 三（）细胞转化 以Ca十十处理的大肠杆菌 C600或MC106作受体菌，按照 Cohen等人81‘方法作 细胞转化，在不同含药平板上氨（基节青霉素，Ap100pg/ml;四环素，Tc,25pg/ml)筛 选不同抗药菌株；在含5-嗅--4-氯--3-吼嗓-,B-D一半乳糖营 (Xgal,40Fzg/ml）平板上筛选 本文于 1982年5月3日收到。 1)本室工具酶组提供限制性内切酶及 T4DNA连接酶，谨致谢意。 4期 敖世洲等：乙型肝炎病毒表面抗原基因在大肠杆菌中的表达 255 lac＋菌株。 （四）分子杂交 菌落原位杂交按 Grunstein和 Hogness1131程序，DNA 片段的墨迹转移和杂交按 Southern[a2，方法进行。用 25‘1标记的 EcoRI-BamHIHBVDNA片段作探针。 五（）琼脂糖凝胶电泳 按前文方法[21［进行。 六（）HBsAg放射免疫测定 1．抗#-gal的制备 按常规方法免疫豚鼠，获得豚抗fl-gal的抗血清，经 pH6.5 磷酸缓冲液平衡的 DEAE-SephadexA-50纯化得到豚抗 ,6-galIgG。对流免疫滴度为 1:4，蛋白含量 2.2mg/mla 2．抗 HBs的纯化和 1251标记 见先前方法31［0 3.HBsAg的免疫分析 50m1LB 对数生长期的含不同质粒的菌体，离心后悬于 Iml50mMTris-HCIpH7.6缓冲液内，加人溶菌酶 I00Fzg,0℃作用30分钟，冻熔三次 裂解细胞，再加DNaseI(10,ug),RNaseA(10,ug),37℃ 作用30分钟，离心除去细胞 碎片，清液作放射免疫测定。