产虾青素酿酒酵母工程菌的构建.pdfVIP

446 中国医药生物技术 2014 年 12 月第 9 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2014, Vol. 9, No. 6 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.006 ·论著· 产虾青素酿酒酵母工程菌的构建 谢贵各，朱丽，蒋宇，戈梅，倪孟祥 【摘要】 目的 对酿酒酵母固有的 β-胡萝卜素代谢途径进行扩展， 构建能够合成虾青素的酿酒酵母工程菌。 方法 对不同来源的虾青素合成基因 crtZ （β-胡萝卜素羟化 酶）与 crtW （β- 胡萝卜素酮化酶）进行随机组合，采用 overlap PCR 技术构建串联表达质粒，并将其导入产 β-胡萝 卜素酿酒酵母工程菌内，发酵产物经 HPLC 和 UPLC-MS 鉴定，确定其成分。 结果 构建出 8 种 TEF1p-crtZ-ADH1t-PGK1P-crtW-CYC1t 组合的串联表达模式，其中基因组合分别为 crtZ 1-crtW 1， crtZ 1-crtW4 工程菌 HCCB08571 、HCCB08572 产生了虾青 素；工程菌 HCCB08566 、HCCB08568 、HCCB08573 未检 测到产物虾青素，而出现了中间产物玉米黄质和斑蝥黄质。 图 1 β-胡萝卜素到虾青素的生物催化途径 结论 成功构建了产生虾青素及其中间体的酿酒酵母工程 Figure 1 Astaxanthin biosynthesis pathway started from 菌。 β-carotene 【关键词】 β 胡萝卜素； 酿酒酵母菌； β-胡萝卜素 羟化酶； β-胡萝卜素酮化酶； 虾青素 crtW 基因，采用 overlap PCR 技术构建成 8 种 中国医药生物技术, 2014, 9(6):446-452 TEF1p-crtZ-ADH1t-PGK1P-crtW-CYC1t 组合的串 联表达模式，以期获得产虾青素的酿酒酵母工程菌。 虾青素是一种脂溶性天然类胡萝卜素，可作为 维生素 A 的前体，其抗氧化功能比维生素 E 强 1 材料与方法 500 倍[1] 。虾青素的自然界来源非常有限，难以满 1.1 材料 足市场需求。其生物合成途径已基本清晰，先是合 1.1.1 菌株和质粒 本研究所用的菌株 成 β- 胡萝卜素[ 2 ] ，然后在 β- 胡萝卜素羟化酶 HCCB08526 和质粒 pYES/KanX-2 由本实验室保 （crtZ ） 藏；E.coli DH5α 及 pMD19-T 购自日本 Takara 、β-胡萝卜素酮化酶（crtW ）两种酶的催化 下[3-5] [6] 公司；工程菌 pUC57-crtZ 1 （crtZ 1 基因来源于 ，经不同的中间体，最终生成虾青素 ，如 图 1 所示。近年来，利用基因工程技术生产虾青 Brevundimonas ）、pUC57-crtW 1 （crtW 1 基因来源于 素的研究陆续发表，如 Huang 等[7]将分别来源于 Nostoc punctiforme ）、pUC57-crtZ2 （crtZ2 基因来源 Haematococcus pluvialis ，chlamydomonas reinhardtii 于 Xanthobacter autotrophicus ）、pUC57-crtW2 的 crtZ、crtW 基因导入西红柿，使得虾青素的产