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电话： 400-600-3979 网址： His-Tag 融合蛋白纯化注意事项 海狸纳米科技 His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，它的优点是表达方便而且基本 不影响蛋白的活性。无论是可溶性表达的蛋白或者包涵体都可以用海狸组氨酸标 签蛋白纯化磁珠 （BeaverBeadsTM IDA Nickel、BeaverBeadsTM IDA Cobalt ） 进行纯化。 BeaverbeadsTM IDA 磁珠的选择： BeaverbeadsTM IDA 磁珠分为镍离子（Nickel ）螯合磁珠、钴离子（Cobalt ） 螯合磁珠。镍离子螯合磁珠与蛋白结合力较强 ，载量较高。每毫升（沉降体积） BeaverbeadsTM IDA-Nickel 的蛋白结合量可达到 40 mg ，每毫升 （沉降体积） BeaverbeadsTM IDA-Cobalt 的结合量约为 25 mg。如果一个蛋白与磁珠结合 力较强 ，想得到较高的纯度 ，可以选择 BeaverbeadsTM IDA-Cobalt。 BeaverbeadsTM IDA 使用常见问题及解析： 1、蛋白不吸附或亲和力低 首先确认纯化前的样品中是否有目标蛋白。 （1 ）有目标蛋白，但大量穿透： a、蛋白不含有标签或未能正确表达。解决措施：Western Blot 鉴定目标蛋 白是否有 His-Tag。若没有，需要重新构建载体，添加组氨酸标签 ，并确认标签 正确表达。 b、蛋白折叠导致组氨酸标签未完全暴露。解决措施：  在样品和平衡缓冲缓冲液中加 1-2M 尿素 ，这样蛋白结构相对松散，也 许能吸附而蛋白不会变性。 电话： 400-600-3979 网址：  在变性条件下纯化蛋白，加入4~8M 尿素或4~6M 盐酸胍使蛋白变性。 如果蛋白有二硫键 ，最好加 1-2mM DTT 或 1~5mM 巯基乙醇（在样 品中添加），可以改善蛋白的吸附。  重新构建载体，将组氨酸标签换到另外一端 ，或在组氨酸标签基因与目 的基因之间增加一段 Linker ，可以降低蛋白折叠后标签被掩盖的几率。 c、标签太短。解决措施：将标签的组氨酸数量增加至 6-10 个。 d、蛋白标签被水解。解决措施：添加合适的蛋白酶抑制剂；尽量在低温下 处理样品；对于分泌表达的蛋白，长时间存放将增加蛋白被降解的风险，应尽快 处理样品。 e、蛋白溶解度偏低或聚集。解决措施：在结合缓冲液中添加 0.5%-1% Tween-20、Triton X-100 ，或5%~50%的甘油 ，可以增加蛋白的溶解度 ，减 少蛋白聚集。 f、样品及结合缓冲液不合适 ：解决措施：确认样品及缓冲液中不含有 EDTA、 还原剂等。另外，将样品及结合缓冲液 pH 调节至 7.4~8.5 ，有利于蛋白结合。 g、样品及结合缓冲液中咪唑浓度太高：解决措施：降低样品及结合缓冲液 中的咪唑浓度。 （2 ）有目标蛋白，但含量很低： 蛋白表达量低。解决措施：对样品进行浓缩，增加磁珠用量、延长反应时间 ； 优化表达条件 （诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间，培养基等 ）；或更换其他合 适的表达载体或表达系统。 2、纯化得到的蛋白量少 电话： 400-600-3979 网址： （1 ）磁珠用量不足。本产品磁珠悬液浓度