基因的获取与鉴定实验报告.docVIP

基因的获取与鉴定 实验目的 掌握质粒提取、感受态细胞的制备、质粒转化、PCR扩增、酶切鉴定、琼脂糖电泳的原理及操作方法。 实验原理 1、质粒提取：质粒提取即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。质粒提取原理 Buffer P1：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA PH=8 Buffer P2：0.2N NaOH，1%SDS Buffer P3: 3M醋酸钾，2M醋酸 ：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长； ：用新鲜的0.4?N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的，NaOH是最佳的溶解细胞的溶剂，不管是大肠杆菌还是细胞，遇到NaOH细胞膜发生从双层膜结构向微囊结构相的变化； ：加入醋酸钾溶液后，十二烷基磺酸钠SDS会生成十二烷基磺酸钾PDS，PDS不溶于水，从而把蛋白沉淀下来，基因组DNA很长也一起被沉淀下来；加入的醋酸用来中和Buffer P2的碱，DNA在碱性环境中不稳定，会断裂基因组DNA。 2、感受态细胞的制备 受体细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。 3、质粒的转化 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。 4、PCR扩增 是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。 5、琼脂糖电泳 DNA迁移率的有关因素：凝胶浓度，核酸分子大小，DNA的构象，电压大小 120V 实验步骤 1、质粒提取步骤： ：取1.5-5ml过夜培养的菌液，8000g离心2min收集菌体，弃掉培养基； ：在沉淀中加入250ul BufferP1，彻底悬浮菌体； ：加入250ul BufferP2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4分钟； ：加入350ulBufferP3，立即温和颠倒离心管5-10次混匀； ：12000g离心5-10分钟，将上清液移入吸附柱，8000g离心30s，倒掉收集管中液体； : (选做)加入500ul BufferDW1，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体； ：加入500ul Wash Solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体； ： 重复步骤7一次； ：空吸附柱于9000g离心1min； ：将吸附柱放在一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50-100ul Elution Buffer，室温静置1min后，12000g离心1min，保存管中DNA溶液待检测。 2、感受态细胞的制备 : 取TG1（空菌）100ul至3ml LB液体培养基摇菌1.5h； : 将菌液1.0ml转移到1.5ml离心管中，冰上放置10min； : 40C离心8min（5000r/min） : 倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽； : 用预冷的0.1mol/LCaCl2 1ml悬浮细胞沉淀，立即放在冰上30min； : 40C离心10min（5000r/min）； : 倒出上清液，用预冷的0.1mol/LCaCl2 200ul悬浮细胞，冰上放置（轻轻吹打混匀）。 3、质粒转化 1) 取1ul质粒，将其加于200ul感受态细胞中，轻轻吹打混匀 2) 冰上置30min3) 42度热激90s4) 迅置于冰上冰浴2min5) 无菌条件下，加400ul LB培养基(不加抗生素)6) 37度摇床培养40min(150r/min)7) 取50ul涂板，次日观察 4、PCR扩增 PCR反应体系在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。10×PCR buffer 2.5μl2.5mmol/L dNTP 2μl （每种dNTP终浓度0.2mM）10μmol/L Primer1 0.5μl（12.5~25pmoles）10μmol/L primer2 0.5μl（12.5~25pmoles）模板质粒 0.5μl（1×10-3pmoles）5U/μl Taq酶 0.5μl dd