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2012-5-16 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：胰蛋白酶活化后Bt、BA与小菜蛾BBMV 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 05911．试验目的 Octet RED System 蛋白互相作用系统是应用专利的BLI（Bio-Layer Interferometry）技术，即生物膜层表面干涉技术进行精确检测。此技术用光纤制成的生物传感器底端覆盖了生物分子相容层，用来固定相互作用分子中的一个，形成生物膜层。相互作用发生时，生物层厚度增加，反射光干涉光谱曲线整体向波长增加方向移动。分子结合或解离时，都会导致干涉曲线的漂移。Octet RED System可进行定量分析（分子之间有无结合，结合的量有多少），动力学和亲和性分析，结合能力和结合的协同性（结合速率Ka，解离速率Kd，结合常数KD）等。它广泛地应用于抗原—抗体、蛋白质分子之间以及药物—蛋白质、受体—配体、DNA与蛋白质之间、核酸—核酸等相互作用的研究中。2010年，Eric Bourhis 等在JBC上发表了”Reconstitution of a Frizzled8-Wnt3a-LRP6 signaling complex reveals multiple Wnt and Dkk1 binding sites on LRP6”，其中hLRP6 和 mFz8 CRD-Fc 与 FA 及 AHC的结合动力学研究中就应用了Octet Red 技术。Octet Red 技术具有操作简单，分析速度快，准确度高（CV值10%），灵敏度高（可检测小至150Da的分子）等特点。它可以计算结合速率常数和解离速率常数等动力学常数。研究利用Octet Red 技术进行中肠蛋白与Bt晶体蛋白及藕合BTA的结合动力学研究，研究BT晶体与藕合BTA与中肠结合活性，并对BT与BTA的作用机理进行比较。研究利用Octet Red 技术2．试验 2.1.1试剂 50mM，PH 10，生物素标记蛋白，Bt晶体（等电点提纯），EDC，NHS，羧基化的阿维菌素（AVM-COOH），DMF，PBS，中肠提取液（BBMVs-buffer），超滤管，离心机，0.25%胰蛋白酶，0：0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺，蒸馏水，分离胶缓冲液，10%APS，TEMED，浓缩胶缓冲液，folin-酚试剂盒。 2.1.2试验器具及仪器Mm Tris-HCl pH 7.5 用中肠提取液溶解中肠，捣碎后，离心取上清，得到中肠粗提物。 2.3.6 用bradford法测定Cry毒素，BtA毒素，中肠蛋白浓度。 在96孔板中将牛血清蛋白（BSA）母液倍比稀释为500 μg/ml, 250 μg/ml,125 μg/ml, 62.5 μg/ml,31.25 μg/ml 5个梯度每孔各50 μl,同时加入50 μl Cry毒素，BtA毒素，中肠蛋白。每孔加入200 μl考马斯亮蓝，静置20分钟后，用酶标仪测得每孔在波长595nm处的吸光值。 2.3.7 将中肠蛋白倍比稀释为16x,8x,4x,2x,1x共5个浓度梯度。 2.3.8上样 Cry毒素与BBMVs结合反应，按下表进行上样 1(Baseline) 2(loading) 3(baseline 2) 4(association) 5(dissociation) A PBS Cry-SA PBS BBMVs(16x) PBS B PBS Cry-SA PBS BBMVs(8x) PBS C PBS Cry-SA PBS BBMVs(4x) PBS D PBS Cry-SA PBS BBMVs(2x) PBS E PBS Cry-SA PBS BBMVs(1x) PBS F PBS Cry-SA PBS PBS PBS 图1 各个阶段反应时间如图1所示。 BtA与BBMVs进行反应，按下表进行上样， 1(baseline) 2(loading) 3(baseline 2) 4(association) 5(dissociation) A PBS Cry-SA PBS BBMVs(16x) PBS B PBS Cry-SA PBS BBMVs(8x) PBS C PBS Cry-SA PBS BBMVs(4x) PBS D PBS Cry-SA PBS BBMVs(2x) PBS E P