打破DNA的物种界限.pptVIP

* （2）真核表达体系 酵母表达体系 哺乳动物细胞表达体系 昆虫表达体系 目录 * 1）酵母表达体系 酵母表达体系兼具原核和真核表达体系的优点。 ① 酵母是最简单的真核生物，其在某些方面与原核细胞类似，繁殖速度快，培养和发酵等操作也较为简单，利于工业化生产。 ② 多种酵母的遗传背景较清楚，基因表达调控机制研究得较为透彻。 ③ 酵母具有真核细胞的特点，能识别内含子，能对蛋白质进行一定程度地翻译后修饰，并且有分泌功能，从而方便了蛋白的纯化。 ④ 不产生毒素，安全性较好。 目录 * 1）酵母表达体系 酵母表达体系的缺点 ① 重组蛋白可发生过度糖基化，从而丧失蛋白的正常功能活性。 ② 不能对目的蛋白进行复杂修饰。 常用的酵母表达体系 酿酒酵母表达体系 毕赤酵母表达体系 多形汉逊酵母表达体系 裂殖酵母表达体系 目录 * 2）哺乳动物细胞表达体系 哺乳动物细胞表达体系的优势 ①目的基因可是基因组DNA或cDNA，转录后能进行加工。 ②目的基因的表达可受到更严格地调控，能使目的蛋白精确地折叠成正确构象，能正确进行糖基化、磷酸化、寡聚体的形成等加工，特别是能进行复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等翻译后修饰，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的高等生物蛋白质。 ③可使蛋白进行分泌表达，从而有利于蛋白的分离纯化。 ④所表达的蛋白不易被降解，且对宿主细胞影响较小。 哺乳动物细胞表达体系的缺陷 ①宿主细胞繁殖速度慢，培养条件要求高。 ②目的蛋白表达水平低。 ③整个操作过程复杂、费时、成本高，难以大规模生产。 目录 * 根据目的蛋白表达的时空差异，可将哺乳动物细胞表达体系分为瞬时、稳定和诱导表达体系。 在瞬时表达体系中，载体DNA不能整合到细胞基因组中，其随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂。 在稳定表达体系中，载体DNA因整合到细胞基因组中而稳定存在于细胞内，目的蛋白能持久、稳定表达。 在诱导表达体系中，目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。 目录 * 哺乳动物细胞表达体系常用宿主细胞 细胞名称 来源 已投放产品 BHK-21 地鼠幼鼠肾 凝血Ⅷ因子 CHO 中国仓鼠卵巢 tPA、Ⅷ因子、EPO、G-CSF、 HBsAg等 C127 小鼠乳腺肿瘤 GH MDCK 长耳狗肾脏 兽用疫苗 Namalwa Burkitt淋巴瘤病人的类淋巴母细胞 EPO、LT、tPA、IFN Vero 成年非洲绿猴肾 HBsAg、GH 鼠骨髓瘤细胞 骨髓瘤 tPA、抗体 COS SV40转化的绿猴肾细胞 CD34、CD69、TGF 目录 * 能进行准确的转录和翻译后修饰、加工。 很少分泌自身的内源蛋白，适合蛋白质的分泌表达和胞内表达，便于下游产物分离纯化。 对培养基的要求低，既可贴壁生长也可悬浮生长。 外源基因被整合入宿主细胞染色体后能稳定保持，具有重组基因的高效扩增和表达能力。 常用的CHO细胞：包括野生型和dhfr缺失突变株。 CHO细胞的特点 CHO细胞是目前应用最广泛的哺乳类基因表达宿主细胞之一。 目录 * COS细胞是利用复制起点缺失的SV40基因组DNA转化非洲绿猴肾细胞系CV-1得到的细胞系。 COS细胞广泛用于外源基因的瞬时表达、基因表达调控和蛋白质结构与功能等方面的研究。 COS细胞的优点 能在无血清的条件下表达外源蛋白，易于培养和转染。 能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的质粒快速扩增。 能瞬时表达大量的外源蛋白。 目录 * 3）昆虫细胞表达体系 昆虫细胞与哺乳动物细胞类似，具有蛋白的翻译后加工、修饰以及转移外源蛋白的能力。与哺乳动物细胞相比，昆虫细胞生长速度快，可不需CO2，甚至不需血清，易于悬浮培养，能较高水平地表达外源蛋白，可以胞内表达，也可以进行分泌性表达。 目前，昆虫细胞表达体系主要有杆状病毒表达体系和果蝇表达体系。 目录 * 杆状病毒表达体系 一般采用将外源基因克隆于专门设计的转移载体上，与病毒DNA共转染细胞后，经同源重组和筛选而得到重组病毒。经重组病毒感染宿主细胞后，即可高水平表达目的蛋白。 一般情况下，杆状病毒表达体系所表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题，将热休克蛋白70与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平。 以Sf9和Sf21细胞系以及家蚕为表达宿主。 表达载体的启动子采用多角体蛋白(polyhedrin)基因的强启动子。 由于杆状病毒的基因组很大，限制性内切酶位点多，难于直接进行常规克隆。 杆状病毒 * 果蝇细胞表达体系 该体系结合了昆虫细胞高水平表达和哺乳类细胞稳定表达且蛋白很少被降解的优点。 主要以S2细胞为宿主