生化技术实验.ppt

生物化学技术实验部分(2010版); 生物化学研究的核心任务： 阐明生命现象的分子机理。;生物大分子物质制备的基本过程：;;一、蛋白质的性质：;二、分离纯化蛋白质的主要方法;有机溶剂沉淀法 ;;有机溶液沉淀法的优缺点;常用的有机溶剂;用有机溶剂沉淀法时应注意的问题 ;温度的控制;pH值的选择;离子强度的选择;分离溶液浓度的控制;及时处理沉淀物;（二）、根据 分子大小和形状的差异分离;施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子;沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析;奠专渊缮硕勇榔畸乌袜故矛吴跑于换碱瘟绑鸦菲朽楷柿屈芒电沏捡即毗浓生化技术实验生化技术实验;凝胶过滤层析的原理: 介质：交联葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）;毯最滁躯虑友吧灰忠宾履旱夕蛔童统滑座投喇炒砸褪圣讽扰锨死伴常塔菇生化技术实验生化技术实验;蒜隔良襄呆迅骆昧扛亏爬吏赁作镀篓渍靴搁弱斌呼粕液诲缮染瘟豪码检卿生化技术实验生化技术实验;支持物的选择：;（三） 根据电荷性质的差异分离 1、电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 支持物： PAGE 、琼脂糖胶等;Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE);玄鸿打划煞涧菌段次制栓珐酷侣廉豌对腑端邵否畜晕上撒射劝揍胁救砾滔生化技术实验生化技术实验;Isoelectric Focusing relies on the migration of charged proteins in an electric field;等电聚焦法;灌歹酮诱刽棉柠腕茅堰肌运骆绊淹障淖颜酵枣拜仕颅隐砧颧旋蕉梧痢厂嚏生化技术实验生化技术实验; 2、离子交换层析法 基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂;裸吻滋见氮一坐分托瞩显徒逼放蛊究芹观晕即携知钨纯垃昔摘脉质恐鉴湾生化技术实验生化技术实验; （四） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析 利用生物大分子能和其配体（例： 酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体）通过次级键专一性结合，而在一定的条件下又可解离的原???进行层析的方法。 用这种层析方法，一次可将物质提得很纯，是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。;掖孤嚎挠涵森铣每熬漂律臻旦蹭懦蘸靖届躯仓梨讽胞名腆举升灼惶副红拽生化技术实验生化技术实验;■ 亲和层析作用机理：;亲和吸附剂的制备;尝摹滁蒜梭扰筑诗蟹们知矫月议误倔至舞辊蔷菩唇班然冶助嗽育水虫带枕生化技术实验生化技术实验;;（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography) ;纯化方案的评价 ;亲和层析纯化胰蛋白酶;胰蛋白酶的制备;胰蛋白酶的性质 ; 胰蛋白酶在pH3.0时最为稳定，低于此pH时酶易变性； 当高于pH5.0以上时，酶易自溶而会失去活性。 提取制备胰蛋白酶的全部过程中应注意溶液的pH值以及在冷室（0一5℃）中进行操作为宜。;胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。 胰蛋白酶原先正常生理条件下，可以被肠激酶、钙离子所激活或自我活化成为有活力的酶。; 猪胰蛋白酶原分子量为24-25kDa之间，而猪胰蛋白酶原激活后，N-端丢失－个6肽，分子量变为23.4kDa，分子构象发生了一定的改变，pI变为10.8。; 胰蛋白酶对R1=Arg和Lys肽键具有选择性水解作用，将蛋白质水解为多肽或氨基酸。; 由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶不会消化正常组织。 在胰脏、鸡蛋清和大豆中，都含有相当量的胰蛋白酶抑制剂。; 胰蛋白酶不仅能够水解Arg和Lys羧基所组成的肽键，而且也能水解酰胺键和酯键。对其催化水解活性的敏感度为： 酯键＞酰胺键＞肽键 ; 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)和弹性蛋白酶三种酶在理化性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们之间彼此彻底分开。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层折技术进一步纯化后，可达到十分满意的效果。;胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵类粘蛋白(CHOM) ; CHOM在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂有较高的耐受性，在碱性条件下易变性，在50%的丙酮或者10%三氯醋酸溶液中仍然有较好的溶解度。 因此选择合适的pH值、丙酮或三氯醋酸的浓度，可以从鸡蛋清中除去大量的非卵类