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EV71疫苗质量控制和评价技术要点 2016年11月16日 发布 手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是婴幼儿人群常见的急性传染病，主要表现为发热和手、足和口等部位的皮疹或疱疹，可并发无菌性脑膜炎、脑炎及急性弛缓性麻痹等中枢神经系统症状，甚至死亡。多种肠道病毒感染可引起HFMD，肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）为引起世界范围内HFMD爆发的主要病原体（1）。HFMD中约90%的死亡病例由EV71感染引起（2），EV71引起的HFMD已成为我国的重大公共卫生问题之一。2015年，我国自主研发的EV71灭活疫苗获批上市（3）。研究制定EV71疫苗质量控制和评价技术技术要点，对规范并提高我国EV71疫苗的质控标准和生产一致性，保证上市疫苗安全、有效和质量可控具有重要意义。 本技术要点中EV71疫苗是指采用传代细胞生产的全病毒灭活疫苗，或采用重组DNA技术将具有免疫保护性的抗原基因克隆到表达载体上，转化相应的宿主中表达的EV71抗原蛋白，经过纯化等工艺制备的EV71疫苗。 本技术要点中凡涉及生物制品质量控制的通用要求，均应按现行版《中华人民共和国药典》三部有关规定执行（4）；有关生产设施的要求应参照国家食品药品监督管理总局（CFDA）2010版《药品生产质量管理规范》执行（5）。 本技术要点仅为对EV71疫苗进行质控和评价技术要求的指导性文件，需根据技术的发展和实际需要进行适当的更新。 EV71属于小RNA病毒科，肠道病毒属，为无包膜病毒。EV71颗粒为20面体的对称结构，直径约24-30纳米，由60个亚单位组成。病毒基因组为单股正链RNA，7400核苷酸左右，包含有5’-UTR区和3’-PolyA尾。 EV71的衣壳蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣壳外部，VP4位于病毒衣壳内部。VP1是EV71主要的抗原表位。EV71只有一个血清型，依据VP1区序列可分为A、B 和 C 3个基因型以及11个基因亚型。我国台湾、香港以及其他国家或地区近年来流行的主要基因型包括B4、B5、C2、C4和C5等亚型（6），我国大陆流行的EV71主要为C4亚型。5岁以下儿童和婴幼儿为EV71易感人群（7）。在后脊髓灰质炎时代，EV71已成为对人类健康危害最大的肠道病毒（8）。 多个国家或地区的企业和研究机构开展了EV71疫苗的研发，疫苗种类包括全病毒灭活疫苗、基因工程重组蛋白疫苗、减毒活疫苗和多肽疫苗等（9）。其中，我国3家企业研发的EV71全病毒灭活疫苗对EV71感染所致HFMD的保护效果分别为97.4%，94.7%和90.0%（10-12）。2015年12月，CFDA批准中国医学科学院医学生物学研究所和北京科兴生物制品有限公司生产的EV71全病毒灭活疫苗上市（3），为我国及世界范围控制EV71感染相关的疾病，特别是严重HFMD的爆发和流行提供了手段。 近年来HFMD流行病原谱发生改变，柯萨奇病毒A组6型、A组10型病毒感染引起HFMD的流行呈增长趋势，提出了研发防控HMFD多价疫苗的需求（13,14）。基因工程重组蛋白疫苗中的病毒样颗粒（VLP）疫苗具有易工业化规模生产的优势，且在动物试验上显示良好的保护效果，显示了研发EV71 VLP疫苗的可行性（15,16）。 本技术要点重点关注EV71疫苗生产的质控和评价，强调生产过程的一致性，同时对研发阶段的疫苗也提出相关标准和要求，以保证研发和生产阶段中疫苗质控和评价方法及标准的衔接。 1. 临床前质控和评价 应依据世界卫生组织（WHO）相关文件以及CFDA《预防用疫苗临床前研究技术技术要点》等技术文件进行EV71疫苗临床前质控和评价研究（17-19）。新研发疫苗的质量标准整体上应达到或高于上市疫苗的标准，动物保护试验中疫苗免疫诱导的中和抗体水平和保护效果应与上市疫苗具有可比性。 1.1 灭活疫苗毒株和细胞基质 疫苗生产用毒株的筛选和确定是灭活疫苗研发成功的关键。应选择主要流行基因型的毒株（目前我国为C4型）作为疫苗候选株进行筛选，重点关注不同毒株的交叉保护能力和遗传稳定性。采用目前世界范围流行的毒株（B4、B5、C2、C4和C5等）及国内不同地区的流行毒株，和/或构建不同基因亚型的假病毒进行保护能力比较，选择中和能力强且中和范围广的2~3个毒株作为EV71候选疫苗株。挑选主要免疫原性区域（VP1）核苷酸序列一致的毒株进行克隆纯化，并规定代次，建立主种子批和工作种子批。进行扩大培养、发酵、收获、纯化及灭活工艺等适应性研究，选择工艺适应性和免疫原性较好的候选疫苗株作为疫苗生产株。检定项目应包括鉴别试验、病毒滴定、免疫原性、无菌检查、外源因子和遗传稳定性等项，各级种子批VP1区核苷酸序