动物肝脏中DNA的提取.doc.docVIP

实验八 动物肝脏中DNA的提取 一、目的学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术 二、原理核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中， 应（4℃）进行， 　　动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/L NaCl），但在0.14mol/L 的盐溶液中溶解度降低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L 盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。三、实验器材 1．?猪肝。 2．?722型（或7220型）分光光度计。 3．?匀浆器 4．?量筒50ml（×1）、10ml（×1）。 5．?离心机（5000r/min）。 6．?离心管。 7．?试管及试管架。 8．?吸管0.50ml（×2）、1.0ml（×2）、2.0ml（×2）、5.0ml（×1）。 四、实验试剂1．0.1mol/L? NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠（pH6.8）。 2．0.015mol/L? NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g 及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3．95％乙醇（A．Ｒ．）。 4．NaCl固体（A．Ｒ．）。 5．5％SDS溶液：5g SDS溶于100ml 水中。 6．氯仿（A．Ｒ．）。 7．V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1。 五、操作1．?称取猪肝8g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入相当于2倍肝重的0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min 下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min 离心20min；取沉淀。2．?在上述沉淀中加入40ml 0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3－异戊醇混合液、4ml 5％ SDS使其终浓度为0.41％，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其浓度为1mol/L（约3.6g）。将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。3．?在上述水相溶液中加入等体积冷95％乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。用蒸馏水溶解并定容至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。4．?提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml 0.015mol/L? NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液中，加入1倍体积的氯仿－异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5 倍体积95％乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。 实验 【实验目的】 1．学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法 2. 掌握RNA组分的鉴定方法 【实验原理】 酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的2.62％～10％)，是工业上大规模制备核酸和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的RNA提取方法，是用稀碱溶液使细胞裂解，使RNA释放到碱液中然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA；或用酸调整pH至2.5，利用等电点沉淀RNA。 RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基，各种成分以下列反应鉴定：①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物—钼蓝。②核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与苔黑酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。③嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 【器材与试剂、】 (一) 器材 1. 150ml锥形瓶 2. 沸水浴 3. 量筒 4. 移液管 5. 吸管及滴管 6. 布氏漏斗和抽滤装置 7. 试管、试管夹及试管架 8. 离心机 9. 滤纸 10. pH试纸 11. 烧杯 12. 天平 13. 酵母粉 (二) 试剂 1. 0.2% NaOH溶液 2. 95％乙醇 3. 冰乙酸 4. 无水乙醚 5. 1.5mol/L H2SO4 6. 浓氨水 7. 5％AgNO3溶液 8. 苔黑酚乙醇溶液 称取苔黑酚6g，溶解于95％乙醇100ml (冰箱中可保存1个月)。 9. FeCl3的浓盐酸溶液 取10％FeCl3 2ml，与浓盐酸400ml混合。 10