虫荧光素酶报告基因用于二英类化学物质的检测.PDFVIP

( ) 第 29 卷 分析化学 FENXI HUAXUE 　研究报告 第 7 期 　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　 2001 年 7 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 825～827 虫荧光素酶报告基因用于二　英类化学物质的检测 张志仁 　徐顺清　周宜开　任　恕　刘志伟 (华中科技大学同济医学院环境医学研究所 ,武汉 430030) 摘　要 　虫萤光素酶报告基因检测二　英类化学物质与传统的 EROD 法比较 ,灵敏度及线性范围均优 于 EROD 法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。适合大量样本的快速筛选及半定量检测。 关键词 　二　英 ,虫荧光素酶 ,报告基因 1 　引　　言 二　英类化学物质在环境中广泛存在 ,毒性作用剂量低且易于生物富集 ,是重要的环境污染物 〔1〕。 二　英类化学物质的监测属于痕量多组份分析 ,通常采用的色质联用法不仅对实验环境和人员有很高 要求 ,而且需耗费大量的时间和财力 ,在实际应用中不易于开展。 二　英类物质产生毒性作用需要与机体细胞核内的二　英反应增强子结合 ,诱导机体的特异基因 (主要为 CYP1A1) 表达 〔2 〕,用于二　英类物质生物监测的方法就是依据这个原理 ,检测特异基因的表达 ( ( ) 〔3 〕 产物 如 7乙氧基异吩　唑酮脱乙基酶 EROD 。据此我们构建一质粒 ,使虫荧光素酶报告基因在 二　英反应增强子的调控之下 ,将该质粒转染入细胞 ,建立一含重组质粒的稳定细胞珠 ,该细胞株可用 于二　英类物质的检测。 2 　实验部分 21 　主要仪器 ( ) ( ) 22R 低温离心机 德国 MIKRO 公司 ;恒温水浴摇床 江苏太仓市实验设备厂 ;2350MP 型二氧化碳 ( ) ( ) 培养箱 美国 SHELLAB 公司 ;LB9507 型弱光仪 美国 EG 公司 ;H51300 超净工作台。 22 　主要试剂 ( ) Hind Ⅲ,BgL Ⅱ,Bamh Ⅰ,EcoR Ⅴ限制性内切酶; PGL3Prometer 载体 Promega 公司 ;2 ,3 ,7 ,8四氯代 ( ) ( ) 二苯并二　英 TCDD 标准品 Accustands Inc. 。 2 . 3 　重组质粒的构建 ( ) 质粒pHAV 和 pMcat 美国哈佛大学医学院 J . P. Whitlock 教授馈赠 ,分别含二　英反应增强子和 ( MMTV 启动子。酶切后以 T4DNA 连接酶连接得含增强子和启动子的目的片段。p GL3Prometer 载代 含 ) 虫荧光素酶报告基因 Hind Ⅲ和 BgL Ⅱ酶切去除了SV40 启动子 ,与目的片段连接。连接产物转化感受 态菌 ,于含 Amp LB 培养基上选择性生长 ,转化菌落酶切鉴定。 24 　细胞的培养 ,短暂、稳定转染及酶