电泳技术的基本原理.pptxVIP

电泳技术的基本原理;带电物质在电场中向其所带电荷相反的电极移动的现象称电泳。 电泳分离生物大分子的原理： 由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，它们泳动的方向和速度也不同。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离和鉴定的目的。;在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝EQ;★ SDS凝胶电泳;SDS凝胶电泳;基本原理;分类;不连续系统;浓缩胶;凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，上层胶的缓冲液中加入PH=6.8的Tris-HCI,下层中的缓冲液中Tris-HCI的PH=8.8。这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。;浓缩效应之二; 样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。;电荷效应之二;电荷效应之三;SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。;上样缓冲液之一?;? 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 ;SDS凝胶电泳实验装置; 垂直板电泳装置;电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。;夹在两块玻璃板之间的凝胶;电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片;标准蛋白分子量;常见问题及处理办法;琼脂糖凝胶电泳;实验原理1;实验原理2;琼脂糖凝胶电泳技术;DNA的琼脂糖凝胶电泳;核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系;凝胶的浓度;缓冲液;电压和温度;marker的选择;操作;影响电泳迁移率的因素;应用;;SDS的优点;SDS的缺点;SDS的缺点;琼脂糖凝胶电泳特点