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病毒载体操作安全手册 病毒载体操作安全手册 引言 根据WHO 生物安全手册对感染性微生物的相对危害程度制订的危险度等级的划分 标准。病毒的危险度为4 级，它对个体和群体的危险均高，通常能引起人或动物的严重 疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗 措施。所以我们需要制定一定的安全注意事项，包括设备的要求、操作人员的防护、操 作的规范性以及废弃物的处理等，以避免潜在的危险。 一、病毒房设备要求 我们知道细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免 微生物及其他有害因素的影响。目前超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细 胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。细胞培养实验室应能进行 六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。病毒房的设备在 普通细胞房的基础上要求更高，尤其是其无菌操作设备。 (一)无菌操作区 1、无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔 离，不能穿行或受其他干扰。理想的无菌操作室应划为三部分： 1 病毒载体操作安全手册 （1）更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 （2 ）缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同 时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 （3) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。无菌操作间的空气消毒：紫外 线灯。 2 、二级生物安全柜：生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等 具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免 暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。 （二）孵育区 本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而 非来往穿行的区域。孵育一般可在恒温培养箱内进行。 （三）制备区 在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备，如条件有限，可以在操作区 进行。 （四）储藏区 主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁 无尘。 2 病毒载体操作安全手册 （五）清洗和消毒灭菌区 清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒 及三蒸水制备等工作。 二、设 备 病毒房除一般细胞房的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两 大类：第一类为常用的基本设备；第二类为较高级的特殊设备。 （一）常用的基本设备 1、仪器： （1）显微镜：倒置显微镜——是细胞培养和病毒包装过程中所必需的日常工作常 规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况、观察有无污染以及病毒空斑形成情况等。若有 条件，尚可配置带有照相系统的高质量相差显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时 电影 拍摄装置等，以便随时观察、记录、摄影细胞生长情况和病毒颗粒形成过程中细胞状态 变化。 （2 ）培养箱：包装病毒的细胞和正常细胞一样，需要在恒定的温度下生存，包装 病毒的细胞对这个要求更高，因为温度的变化会影响细胞的出毒情况，从而影响最终病 毒的浓度和滴度。大多数情况下，最适温度是37℃，温差变化一般不应超过±0.5 ℃，细 3 病毒载体操作安全手册 胞在温度升高2 ℃时，持续数小时即不能耐受，40 ℃以上将很快死亡。因此需要有能控 制温度的培养箱，如具有较高灵敏度的恒温培养箱及CO 培养箱。 2 （3 ）干燥箱：用于细胞培养箱和病毒培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使 用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，电热干燥箱升温较高，