shRNA详细原理及引物设计.doc

shRNA 克隆）利用网站提供的软件设计DNAoligo： http://genomics.jp/sidirect/ /DesignCenter/DesignCenterPage.aspx /techlib/misc/siRNA_finder.html 举例：HEXIM1shRNA设计 ”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列 设置只要将contiguous sequences to avoid-As or Ts 选上, 如图下 点design siRNA 结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看 优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基 B: Dharmacon 输入accession number, step 4中选blast, database选human 点”design siRNAs” 结果: 优先选择score高, mismatch为3或大于3, 且不要化学修饰的序列 C: Ambion 序列可由SiDirect或其他位置粘贴过来, 设置中选中”4. Sequence constraints to avoid: 4 or more As or Ts in a row”, 点submit 结果: 本网站生成的序列全部以AA开头, 后19位为所要序列 最终结果 完全重合很难实现, 所以也接受小部分不重合. 举例: 得到以下结果, TT CAACAGCTGGGCAAGTTTA AG 1619 AA CAGCTGGGCAAGTTTAA GG 1622 Matched by SiDirect, Dharmacon (1619) and Ambion (1622) 然后随便选择一段, CAACAGCTGGGCAAGTTTA (起点1621) 或CAGCTGGGCAAGTTTAAGG (1624)均可 标注为”sh+基因+起点” 如: shPRKD1-2616 注：由于所设计的每个oligo并不都具有knockdown效果，针对每个protein设计oligo时，一般设计4-5个以便筛选。 2．shRNA设计model shRNA design Model A. New pSUPER-BX and pSR-H1 shRNA design model: BamHI-XhoI site sh F: 5’-GATCGGG TTCAAGAGA TTTTTC-3’ sh R: 5’-TCGAGAAAAA TCTCTTGAA CCC-3’ Example: shCdk2-85 F: GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC shCdk2-85F: GATCGGGGGTGGTGGCGCTTAAGAAATTCAAGAGATTTCTTAAGCGCCACCACCTTTTTC shCdk2-85R: TCGAGAAAAAGGTGGTGGCGCTTAAGAAATCTCTTGAATTTCTTAAGCGCCACCACCCCC B. Old pSUPER shRNA design model: BglII-HindIII site sh F: GATCCCC TTCAAGAGA TTTTTA sh R: AGCTTAAAAA TCTCTTGAA GGG Example: shCdk2-85 F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC shCdk2-85F: GATCCCCGGTGGTGGCGCTTAAGAAATTCAAGAGATTTCTTAAGCGCCACCACCTTTTTA shCdk2-85R: AGCTTAAAAAGGTGGTGGCGCTTAAGAAATCTCTTGAATTTCTTAAGCGCCACCACCGGG 二．合成后DNAoligo的溶解 用经高压灭菌后的ddH2O将DNAoligo定量至3μg/μl ddH2O的体积(V/μl)=DNAoligo的质量（mg）×1000／3三．DNAoligo的退火μl） 正向DNAoligo（F）: 1μl 反向DNAoligo（R）: 1μl 10×退火Buffer ： 5μl ddH2O ： 43μl 2）用石蜡膜将EP管口封好。 3）将EP管放入事先煮沸的电磁锅中，煮沸4min。 4）关闭电源，将电磁锅