第八章分子生物学研究方法.pptVIP

第四节 分子杂交技术 片段扩增倍数 （二）重组DNA的转化 1、转化 指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。 此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。 （1）将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。 步骤： （2）与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。 （3）立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。 （5）涂布于选择性培养基中分离转化子。 （4）在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复 2、转染和感染 感染：在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。 转染：在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 （一）抗药性标志的筛选 （二）β－半乳糖苷酶系统筛选 （三）菌落快速裂解鉴定法 （四）内切酶图谱鉴定 （五）通过聚合酶链反应筛选重组子 （六）菌落或噬菌斑原位杂交 六、重组质粒的筛选和鉴定 杂交(hybridization) ：来源不同的两条彼此的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。（注意与复性的区别） 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。 分子杂交是目前分子生物学最广泛应用的技术之一。利用此技术，可以求出特定基因的频率、基因组织的特点、基因结构和定位、基因表达等。 电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法、 菌落和噬菌斑印迹法 E.M. Southern于1975年首先设计出来的。 材料： 尼龙滤膜 硝酸纤维素滤膜 二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） 步骤： 第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移 第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA探针进行杂交 一、Southern印迹杂交 Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交（放射性和荧光检测） 5.结果检测 二、Northern印迹杂交 是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 三、斑点杂交 Step 1. Antibody Recognition of target protein/antigen Step 2. Secondary Antibody recognition of primary Ab Step 3. Color Development 四、Western印迹杂交 五、原位杂交（教材P175） 组织原位杂交简称原位杂交（in situ hybridization），是在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与RNA或DNA杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。 基本步骤是通过适当处理使细胞渗透性增加，探针进入细胞内与DNA或RNA杂交、冲洗等。用放射自显影或免疫酶法或荧光显示杂交结果。 Localization of DNA Localization of RNA 六、基因芯片 基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 (教材p.214-218) （一）基因芯片的种类 1、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列 2、微电子芯片 3、微量点样技术 4、其他技术 （二）应用领域 1、科研领域 2、生物制药领域 3、医学诊断 七、酵母杂交技术 （一）酵母双杂交技术 1、基本原理 2、改进和发展 (教材p.206-208) （二）酵母单杂交技术 1、酵母单杂交技术的原理 2、酵母单杂交技术的应用 第五节、基因扩增与定点突变技术 一、聚合酶链式反应（PCR） (教材p.165-170) （一）PCR反应中的主要成份 1、DNA模板 2、dNTPs 3、引物 4、Mg++ 6、反应缓冲液 5、DNA聚合酶 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： 长度约为16-30bp; G+C含量通常为40%-60%; 四种碱基应随机分布; 3‘端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位 核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不