糖分离纯化及含量测定1.pptVIP

连接次序：选择性光谱法、糖苷键顺序水解、核磁共振法 α－、β－异头异构体：糖苷酶水解、核磁共振； 羟基被取代情况：甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、Smith 降解法和测硫酸基法(terho 法)、核磁共振法、质谱法; 糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应； * 多糖结构的分析方法很多，迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析。仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法。 * 结构测定——多糖高级结构测定 研究多糖的二级结构常用的手段是NMR 技术，如2D－NMR，13C-NMR谱，通用的方法是将现代NMR 技术与理论计算相结合，通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算。 圆二色谱法（CD）也可用于糖的构象分析。 * 近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所未有的深度和广度，多糖作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势必推动对多糖的认识向深层次发展。 * 谢谢！ * * 标题处建议用英文标题，以英文文章的格式来做幻灯片，这样便于以后写文章时直接调用数据。 Sevage 法 根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用V(氯仿)∶V(戊醇或正丁醇)为5∶1 或4∶1，混合物剧烈振摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶，离心分离，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。 一般按多糖水溶液的1/5~1/4体积加入。 * 此种方法只能除去少量蛋白质，须反复多次，多糖有损失，得率不高, 且氯仿对人体也有一定毒性, 操作时应注意。 该法优点是条件温和, 可避免多糖的降解。利用蛋白酶可水解蛋白质的特性, 在多糖样品溶液中加入一些蛋白质水解酶如中性蛋白酶和糜蛋白酶, 再用Sevage 法效果更佳。 此法不能除去脂蛋白，因为脂蛋白溶于氯仿。 * 三氯乙酸法 三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。 该法是在多糖水提液中滴加5%～10%与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖。 * 三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。 * 三氟三氯乙烷法 将多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温搅拌10 min 左右，离心分离得上层水层，水层继续用上述方法反复处理几次，得无蛋白质的多糖溶液，此法效率较Seavg 法高，但溶剂沸点低，易挥发，不宜大量应用。 * 2. 色素的去除 中草药来源的多糖, 可能含有酚型化合物而颜色较深, 这类色素大多呈负性离子,不能用活性炭吸附剂脱色, 可以用弱碱性树脂DEAE-纤维素来吸附色素,这样不仅可以达到脱色的目的, 而且可以进行多糖的分离。 若多糖与色素结合, 易被DEAE 纤维素吸附, 不能被水洗脱, 这类色素可用低温氧化法脱色，温度较高下氧化易引起多糖的降解。 * 对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖, 可通过生成金属络合物的方法以同时除去蛋白和色素, 方法是加入菲林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等与多糖生成不溶性络合物, 经分离后用阴离子交换树脂分解络合物得到多糖。 * 3. 多糖的纯化 超滤法 季胺盐沉淀法 柱层析法 色谱法 其他方法 * 超滤法 膜分离技术（membrane separation technology，MST）是一种高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分有选择性的通过膜。目前应用较多的是超滤和微滤技术。如采用中空纤维超滤膜, 对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤去除小分子杂质。 * 季胺盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂, 可与酸性糖形成不溶性沉淀, 常用于酸性多糖的分离。当溶液的pH 值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高, 也会与中性多糖形成沉淀。 常用的季铵溴化物(CTAB) 及其氢氧化物(CTA-OH) 和十六烷基氯化吡啶 (CPC) , 其浓度一般为1% ~ 10% (W /V ), 它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分离出酸性多糖。 * 柱层析方法 纤维素柱层析 阴离子交换柱层析 凝胶柱层析 亲和层析 * 纤维素柱层析 柱中的载体是纤维素。先用乙醇液将柱内纤维素平衡好, 然后将多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素上面。用不同浓度乙醇水溶液(如80%, 60%, 40%, 20% ) 梯度洗脱, 则不同多糖就依次洗脱出来。先洗脱的是分子量最小的多糖, 最终洗脱的是分子量最大的多糖。在洗脱过程中, 由于各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程, 最终