癌症生物标记物的高灵敏检测.pdf

中文译文 译者: 同昕生物技术(美国)有限公司Liana Bates 博士，www.tarcine.us 癌症生物标记物的高灵敏检测 PCR 检测基因突变法抑制野生型模板DNA 的扩增，选择性的扩增突变模板 Michael Powell 博士，张爱国博士 在癌症的个体化治疗中，肿瘤突变检测的 “金标准”是DNA 测序。但是，其检测效果并不是 非常令人满意的。最近的科学研究表明，DNA 测序法可能是最不灵敏的检测突变的方法之一。事 实上，基因突变在样品中的含量必须要达到10-20%，才能使用DNA 测序法顺利的检测到。在此 阈值之下，基因突变有可能无法被检测到。结肠肿瘤就是一个很好的例子，大部分或者全部结肠 肿瘤都是多克隆和多种癌变混合体。在一例结肠肿瘤的研究中，FDA 附属机构的研究员做出了肿 瘤突变可能无法用标准的DNA 测序法检测到的结论。 为了增加灵敏度，其他的方法也已经被尝试过。其中包括在Real-time PCR 基础上发展的检测 方法，比如特定等位基因PCR （ASPCR ）和使用水解基础上的探针。虽然这些方法展示出了更好的 灵敏度，降低了至少5%的检测阈值，他们还是不能满足最重要的目标：在低于样品含量1% 的组 织样品中检测到突变。这些技术都是有局限的，因为他们不能降低样品中大量野生基因组DNA 的 干扰。此外，水解基础上的探针没有特异性，不能有效检测EGFR T790M 和JAK2 外显子14 的突 变。 最近，微滴式数字PCR （ddPCR ）技术已经发展到可将灵敏度提高至检测0.1% 突变DNA。这 个技术使用百万个微滴将突变DNA 和野生基因组DNA 分离开。但是，机器制备的有些微滴同时 含有野生和突变DNA，这些微滴为使用临床样品的检验人员制造了一个麻烦。野生DNA 继续生成 强大的背景干扰，从而导致灵敏度还是无法顺利的达到0.1% 。在混合的活检组织或是血清、血浆 中的cfDNA 中检测和量化低于1%的突变是更大的挑战。 另辟蹊径的检测方法 为了减低野生DNA 背景干扰和提高灵敏度，一个分子夹被设计成选择性的与野生DNA 模板 杂交，阻断其扩增。这个分子夹含有一个合成的，有序列特异性的Xeno-核酸（XNA ）探针。这就 是QClamp 技术。在下列基因突变出现在XNA 探针的序列中时：单核苷酸多态性SNP 基因缺失、 基因插入以及重排，XNA 探针会在PCR 循环过程中从突变模板DNA 上解链下来，只让有突变的 DNA 模板被有效扩增。（见图1）。 图1. 改造过的DNA 寡聚脱氧胸苷酸探针结合或夹住野生型DNA，阻断其进一步扩增。 这个探针，又名XNA 夹，不和突变DNA 结合，允许其进一步扩增和被检测。 QClamp 是一个灵敏和精确的量化PCR （qPCR ）技术。它可以阻断样品中野生DNA 的扩增。另外，它 还可以检测到从病人肿瘤活检或全血样品获取的DNA 中的低频率基因突变（0.05% ）。这个层次的灵敏度 使得检测癌症治疗临床环境中使用病人活检，手术组织，或是福尔马林固定石蜡包埋组织样品 （PPFE）检 测基因突变成为可能。 QClamp 技术特别适合于“液态样本检验”，即适用于检测血浆和尿中的肿瘤衍生的脱细胞DNA。目前其 灵敏度与微滴式数字PCR （ddPCR ）相当甚至更高，达到0.05%，而且只需使用标准的qPCR 实时定量检测 仪器。初步试验表明，使用新的遗传工程技术 （导向进化和选择技术）制作的DNA 聚合酶，灵敏度还可以 进一步提高。 QClamp 技术的临床应用评价 QClamp 技术已经被相当数量的大医院，中心实验室和生物制药公司评估过。最近，一家美国知名的诊 断服务公司正在积极评估不同的癌症检测平台，用于检测组织样品和PPFE 样品中EGFR T790M 在外显子20 的突变。无需DNA 提纯，QClamp 成功的直接从FFPE 样品中检测出所有的临床相关EGFR 突变，包括 T790M 。高清的解链曲线见图2 。 图2. 由QClamp EGFR 检测法制作的临床相关EGFR 突变高清解链曲线(HRM) 另外，在此评估中，去除白细胞的全血与含已知比例 （50%，20% ，20%，5%，1% ，0.5%，和0% ）的 JAK2 野生型和MUT617 DNA 一起混合做检测。这些样品由PCR-r