验一 收集动物组织的活细胞—RH.pptVIP

显微镜的组成部分 目镜 观察筒 物镜转换台 物镜 标本夹 载物台 X,Y轴旋纽 电源开关 光强调节纽 光源 聚光镜升降旋钮 光阑调节器 * 调节瞳间距调节屈光度 所需物镜、 聚焦 5、 4、 1、 放入 样品 转换 聚光镜 10X 物镜 2、 3、 40X 物镜 观察 6、 明场观察 ⑴ 观察步骤 * 思 考 本次实验要解决什么问题？ 采用什么方法来解决这些问题？ 还能用其他什么方法来解决这些问题吗？ 应用这些方法还能解决什么问题？ * * Hanks液:平衡盐溶液. 溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。 * * 台盼蓝染色法原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。 中性红染色液(活细胞染色用)(Neutral Red Staining Solution)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成红色的染色液。本染色液配制在pH值较接近中性的，并且和普通的细胞培养液等渗的溶液中，可以用于外周血细胞的活体染色，也可以用于其它活体细胞或组织的染色。????中性红同时也是一种pH指示剂，在酸性时呈红色，在pH6.8-8.0时呈黄色。细胞核中的核酸呈酸性，因此细胞核会被染成红色。由于溶酶体中也是酸性环境，因此溶酶体也是可以被酸性红染色液染成红色的。 * * 实验一 收集动物组织的活细胞并计数和测定成活率 * 问 题 如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板的数量？ 如何知道水样中某小型生物的数量？ 如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？ 如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？ * 实验目的 学习机械分离法获得动物组织的活细胞 学会使用血球计数板测定细胞悬液的细胞密度 掌握活细胞和死细胞的鉴别方法 * 收集动物组织的活细胞 从组织中分离单细胞的方法有多种： 对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采用机械研磨的方法分离细胞，但这会造成一些细胞的损伤而降低细胞的成活率； 对于比重差异较大的细胞，可以采用离心的方法来分离，例如血液中各种血细胞的分离； 对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔的方法获得。 * 实验材料 小鼠 小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。 * 小鼠的处死：颈椎脱位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。 * 脾脏淋巴细胞悬液的制备 1.机械分离法 用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗中，用D-Hank’s 液冲洗尼龙布，收集细胞悬液于离心管中。 2.低渗溶解红细胞（红细胞溶血） 0.87% NH4Cl 溶液 * 股骨骨髓细胞悬液的制备 冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hank’s液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。 * D-HANK’S液(无钙镁离子的HANK’S液) 配方 NaCl 80.0克 Na2HPO4?2H2O 0.6克 （如为12H2O，则需1.2克） KCl 4.0克 KH2PO4 0.6克 双蒸水 1000毫升 原液稀释10倍即为使用液------ D-Hank’s液 * 细胞计数和细胞存活率 利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细胞计数和细胞存活率的测定。 细胞计数一般用血球计数板，细胞存活率的测定一般采用染色法。 细胞密度：每ml细胞悬液中的细胞数 细胞成活率：总细胞中活细胞所占的百分比 * 血球计数板的结构 血球计数板是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网。 * 每一方格网可分为九个大方格。 四角4个大方格分别被分为16个中方格。 中央大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。中央大方格共含有400个小方格。 双线分隔 * 血球计数板的原理 白细胞计数法采用四角4个大方格的区域，适用于细胞较大数量较少的样品 红细胞计数法采用中央大方格的区域 * 血球计数板的原理