一分光光度技术及蛋白含量测定.pptVIP

实验一 分光光度技术及蛋白含量测定 * 理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造 实验 利用分光光度计进行蛋白质定量测定 1.双缩脲法测定蛋白质含量 2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.紫外分光光度法测定蛋白质含量 本次实验内容 * 分光光度技术（Spectrophotography） * 一、基本定义 利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 。 应用：定性、定量 优点：灵敏度高 精确度高 操作简便、快速 * 二、工作原理 1.物质对光线有选择性吸收作用。 2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比。 分光光度法所使用的光谱范围： 200nm -- 10μm 200-400nm 400-760nm 760-10 000nm 紫外光区 可见光区 红外光区 * 如何定性？ — 利用吸收光谱鉴定化合物 利用分光光度计绘制吸收光谱曲线 用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。 每种物质有其特征性的吸收光谱 * 1. 朗伯（Lambert）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。 I/I0=e-K1l I0 :入射光强度； I :透射光强度；l ：介质厚度 如何定量？ — Lambert - Beer定律 * 2．比尔（Beer）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。 I/I0=e-K2C I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 * 3.Lambert-beer’s law的合并 一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 I/I0=e-εcl A=-lg I/ I 0=εcl A：吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度 ε：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为 mol/L,光程为1cm时的消光系数 * 4.计算 （1）标准管法（标准比较法） 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准=ε标准C标准L标准 A样品=ε样品C样品L样品 A：吸光度；ε ：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度 * 因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品= ε标准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准 故上二式可写成： A标准/A样品= ε标准C标准/ ε样品C样品 C样品=A样品/A标准 × C标准 * （2）标准曲线法 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。 以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。 * 标准曲线使用注意事项 ①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ②吸光度在0.05-1.0范围内。 ③所作标准曲线仅供短期使用。 ④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。 * 5．应用中注意的问题 ① Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符 ② 选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干 扰 ③ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。 * 空白管：