小鼠淋巴细胞分离液说明书-bio.PDF

小鼠淋巴细胞分离液说明书 Cat# : DKW33-R0100/DKW33-R0400 本品为深圳达科为生物技术有限公司自主研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为 Iodixanol，分子量为 1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白、不会干扰任何细胞表面 膜蛋白、不会抑制酶活性、不会干扰抗原抗体反应。 小鼠淋巴细胞分离液分离的淋巴细胞的纯度高、状态好、得率高。小鼠脾脏淋巴细胞分离方法操作简单、 易学，对实验者的经验要求不高。 本实验室的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞暴露在该分离液中长达 1 小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和 质量没有明显变化，随后的 ELISPOT 检测结果同其它组完全一致。 产品信息： 商 品 名：Mouse 1× Lymphocyte Separation Medium 内 毒 素：0.5EU/mL 小鼠淋巴细胞分离液 适用范围：分离小鼠/大鼠脾脏淋巴细胞 规 格：100mL/瓶 分离大鼠/兔子血液中的 PBMC 密 度：1.0810±0.0005g/mL (20 ºC) 保存方法：4 ºC 避光保存，保持无菌 渗 透 压：280±15mOsmol/kg 保 质 期：12 个月 主要成份：Iodixanol ，化学惰性，无生物毒性 使用方法： 自备材料：35mm 培养皿、10mL 玻璃注射器内活塞、200 目尼龙网—— 裁成 90mm×90mm 正方形（以上材料均为无菌要求）、其他常 用器材：离心管，移液管，加样枪，离心机等 实验步骤： 1. 断颈处死小鼠，浸泡于 75% 的乙醇中。 2. 在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在 35mm 培养皿中放入 4-5mL Mouse 1×淋巴细胞分离液（取用前恢 复至室温并摇匀）。研磨（研磨操作请参考图二）。 4. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离心管中，覆盖 200-500 uL 的RPMI 1640 培养基（保持液面分界明显）。 5. 室温，800g 离心 30min 。设置较慢的加速度和减速度，如果有十档， 设为第三档。离心结束后细胞分层如图一所示。 6. 吸出淋巴细胞层，再加入 10mL RPMI 1640 培养基，颠倒洗涤。室温， 250g 离心 10min 收集细胞。 7. 倾倒上清液，用无血清培养基或其他培养液重悬细胞，细胞计数。 深圳市达科为生物工程有限公司 地址：深圳市南山区桃园街道光前工业区 20 栋 4C 邮编：518055 Tel:800 830 4366 / 0755Fax:0755Web: E-mail:RD@ 1/4 注意： 若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠 分离液等体积稀释并混匀后，再进行第 4 步操作。 分离液易挥发，每个脾脏的研磨时间应控制在 5min 以内。 大鼠脾脏淋巴细胞分离操作： 因大鼠脾脏较大，只须剪取一小部分进行实验即可，研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离操作完 全相同。 大鼠／兔子血液中淋巴细胞分离操作： 1. 新鲜抽取的大鼠/兔子抗凝外周血 2-4mL 用 RPMI 1640 稀释一倍（血液稀释后分离效果更佳，注意无 菌操作）。 2. 在 15mL 离心管中加入 3mL 淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液面 上层，避免两种液体界面混合。 3. 室温，800g 离心 15~20min。设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，设为第三档）。 4. 后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。 特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法： 推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。 推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。 关键所在，利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度。将细 胞可能受到的机械损伤降低到最小。 注意： 1. 控制研磨力度