侧序列对大肠杆菌中童组贡粒表达的影响.PDFVIP

遗传学报，19(2);186-191,1992 ActaGeneticaSinica 核糖体结合位点序列对大肠杆菌中 HBcAg重组质粒表达的影响 李 满 马贤凯 军（事医学科学院基础医学研究所，北京100850) 用 Bat-31外切酶调整乙肝病毒核心抗原 H（BCA约 基因非编码区长度并克隆到质位 pKK223--3中，获得了不同水平地表达 HBcAg的重组质粒 pKL系统。 该系统所表达的一 HBcAg蛋白分子量为21000DoDNA序列分析发现高、中、低表达水平的3个重组质粒的 SD序列到 HBcAg基因的ATG之间的距离分别为126p,136p和19bp，高、低表达质粒的， mRNA核糖体结合位点序列的二级结构分析显示，二者的自由能相差约3倍，且低表达质校 的mRNA的SD序列中的3个碱基及 AUG 中的3个碱基都参与配对，而高表达质粒只有 SD序列中的2个碱基参与配对，表明SD序列到ATG的距离及 mRNA 的二级结构均在 HBcAg的表达调控中起重要作用。 关键词 基因表达，核糖体结合位点，mRNA二级结构，DNA序列分析，HBcAg mRNA的翻译是基因表达的一个重要环节，而其起始效率又直接影响表达水平。在 大肠杆菌细胞翻译起始区的核糖体结合位点，除了SD序列与16srRNA3端序列的互 补程度直接影响mRNA结合到核糖体上的能力外，SD序列与 ATG之间的距离以及 mRNA的二级结构均为决定翻译效率的重要因索、’，”，其差别可导致蛋白产量相差千倍 以上，如本室曾发现AUG下游的mRNA二级结构对乙肝病毒核心抗原H（BcAg）在 大肠杆菌中的表达有数千倍的影响田。但由于该产物为融合蛋白，不易进行5’端非翻译 区的二级结构分析，故本文构建了一系列表达非融合性HBcAg的重组质粒，以探讨 SIB 序列到ATG的距离以及核糖体结合位点的mRNA二级结构对表达水平的影响。 材 料 和 方 法 一（）材料 菌株和质粒 E.coliK12Jm103 △（(lacpro).,FIaclQZOM15prop),噬菌 体M13mp18,M13mp19购自美国Biolabs公司。质粒 pMM2066为本室构建的 HBcAg表达质粒；质粒pKK223-3由MichaelJ.Tocci赠送。 二（）方法 1.DNA操作 DNA的常规操作按文献 7［］进行，Bal-31反应在0.02u/zlgDNA 浓度下于”。℃和’b℃进行，不同时间终止。按文献8〔1进行M13克隆制备模板DNA,甩 双脱氧链终止法进行序列分析。 本文于 1990年1月15日收到。 2期 李 满等：核糖体结合位点序列对大肠杆菌中HBcAg重组质粒表达的影响 187 2.HBcAg抗原反应活性的鉴定 (1)ELISA检测：用超声破碎法制备10ml培养物的菌体裂解液上清，以，ml悬 液为原液，稀释后进行 ELISA检测，P/N72.1为阳性。 (2)SDS电泳及Westernblot鉴定；电泳分离菌体蛋白后，将胶的一半用 于进行酶染检侧，确定HBcAg的位置。 3.mRNA二级结构的计算机分析 参照文献 1〔0]进行。 结 果 一（）pKL系统重组质粒的构建及鉴定 如图1所示，HBc,4g基因片段经 Bal-31外切酶修饰后与载体 pKK223-3进行 平端连接构成了pKL系统的重组质粒。 用 ELISA 法筛出 HBcAg阳性克隆，并经 BamH1和 BgIII酶切鉴定证实这些克隆确有 HBc4,g基因插入 （图2)0 图1pKL系统重组质粒的构建 Fig.1 ConstructionofpKLseriesrecombinantplasmid 188 遗 传 学 报