克隆操作流程.docxVIP

生产部克隆组操作流程一、PCR扩增目的片段实验原理:PCR(polymerase chain reaction)是一种常用的分子生物学技术，常用于体外扩增特异的DNA片段。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（有时直接用单链DNA作为模板），以便它与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三个基本过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。1、实验仪器及试剂1.1实验仪器：PCR仪： LongGene L96+ Thermal cycler离心机：TGL-16, 湘仪凝胶电泳仪：Tanon EPS 300凝胶成像系统：Tanon 2500，其林贝尔离心机：LX-5000微波炉1.2实验试剂：天根pfu DNA polymerase(2.5U/ul)天根dNTP（10mM/ul) TAKARA DNA marker（DL5000、DL10000）1XTBE缓冲液超纯水2、实验步骤：(1)将干粉引物以12000rpm离心30s，小心打开管盖按照引物订单报告加灭菌的超纯水稀释至10mM，震荡混匀（打开盖子前一定要离心，避免干粉引物飞溅）。（2）在0.2ml的离心管中加入以下成分：质粒模版（25ng/ul）1ulPrimer1（10mM）1ulPrimer2（10mM）1ul10×Pfu Buffer5uldNTP mixture（10mM）1ulPfu DNA 酶(2.5u/ul)0.5ulddH2O?ul总体积50ul（模板一般可以是质粒、单或双链DNA片段、cDNA等或其他不同复杂类型的模版，加入的量有一定的变化。一个典型的50ulPCR反应，加入的模板量为0.1ug-2ug；dNTP的浓度为50umol/L-200umol/L；每条引物的量为0.1umol-1umol，加入的酶为1.5U-2.5U。最后加水保证总体积为50ul，做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装，离心5s混匀，然后置于PCR仪的工作台上）。（3）设置PCR运行参数并运行：（4）用微波炉加热0.75%琼脂糖凝胶至完全溶解，在胶板上插上梳子倒一块胶，静置凝固。（5）PCR反应结束后取2ul产物进行电泳，检验是否扩增成功，确定有目的条带后其余样品进行PCR产物纯化（或胶回收）。二、PCR产物的纯化（或者切胶纯化）实验原理：PCR产物一般都含有过量的引物、DNA聚合酶、引物二聚体、模板DNA及dNTP等，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切反应、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验采用Biospin胶回收试剂盒对PCR产物直接进行纯化，Extraction Buffer促进60bp-23kb间的DNA片段选择性的吸附在膜上，经Wash Buffer洗涤除去引物二聚体、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料等，最后经去离子水将目的DNA片段从膜上洗脱下来。1、实验仪器及试剂1.1实验仪器：湖南湘仪离心机：TGL-16,金属恒温加热器：博彩生物 HB3011.2实验试剂：Biospin胶回收试剂盒超纯水2、直接纯化实验步骤：（1）向PCR产物中加入5倍体积的Extraction Buffer,混匀。（2）将混合液全部转移到吸附柱，静置2分钟，8000rpm离心1min,弃去收集管中的液体（静置是为了保证吸附膜能充分吸附DNA）。（3）向吸附柱中加入500ul Extraction Buffer，12000rpm离心1min,弃去收集管中的液体(洗去残留在吸附膜上的酶蛋白物质)。（4）向吸附柱中加入750ul Wash Buffer（初次使用时按照说明书加入相应体积的无水乙醇），静置5min，12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体（洗去吸附在膜上的离子盐类等物质）。（5）12000rpm空离2min（离心除去吸附在膜上的乙醇，避免对后续实验的影响）。（5）将吸附柱转移到灭菌的1.5ml的离心管中，静置1min（静置使乙醇完全挥发