dna探针、cdna探针、rna探针和寡核苷酸探针.ppt

教学要求 ①核酸杂交的原理，印迹技术的基本原理。 ②杂交技术，转膜的三种方法：Southern、Northern、Western杂交。菌落杂交、原位杂交、斑点杂交、液相杂交。 ③探针的概念（广义、狭义），种类，作为探针的条件，探针标记物及优缺点。 ④探针标记的方法。 部分答案 1.分子杂交：互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交。 2.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的，已知并被标记的核苷酸序列。 3.什么是探针？什么是核酸探针？简述核酸探针的种类。 探针是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的，已知并被标记的核苷酸序列。常用核酸探针的种类有：DNA探针、cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。 第三节?核酸分子杂交技术 一、核酸分子杂交方法的分类 核酸分子杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。 （一）液相杂交 液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。没有固相杂交应用的普遍，目前常用的液相杂交有RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。 例：RNA酶保护分析法（RNase protection assay, RPA）是利用RNase A和RNase T1能专一性降解单链RNA而双链RNA则受到保护的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体被保留，而未形成双链的RNA被降解。此法可用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。具体过程是：制备待测RNA→制备RNA探针并标记→杂交→除去单链RNA→回收双链，电泳分析。 RNase （二）固相杂交（固-液相杂交） 固相杂交是通过各种方法将待测核酸分子固定在固相支持物（如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和滤纸）上，然后用标记的探针（在溶液中）与被固定的分子杂交，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，经显影后即可检测出支持物上留下的杂交物（DNA或RNA分子）所处的位置。该法比液相杂交容易检测，并能防止靶DNA自我复性，所以最为常用。但杂交前需要进行预杂交。 支持物(膜) 适宜的条件杂交后洗膜 探针溶液 若是将存在于凝胶中的生物大分子（核酸、蛋白质）转移(印迹)于固定介质上并加以检测分析的技术称为印迹技术(blotting)。目前这种技术已被广泛用于DNA（Southern印迹杂交）、RNA（Northern印迹杂交）和蛋白质（Western 印迹杂交）的检测。典型的印迹技术包含三项基本工艺：凝胶电泳、样品转移和杂交分析。核酸分子杂交与印迹技术相结合为DNA 和RNA的分析提供了有效手段。 凝胶 支持物 常用的固相杂交类型有： 菌落原位杂交 组织原位杂交 斑点杂交 狭缝杂交 Southern印迹杂交（检测DNA） Northern印迹杂交（检测RNA） Western 印迹杂交（检测蛋白质） 原位杂交：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法 1.菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 通常用于筛选，将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落进行原位裂解释出DNA，再烘干固定DNA于膜上，与32P标记的探针杂交，检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 与平板对应，找出阳性克隆（注意方向） 2.组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义,能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA序列。 若检测蛋白质——免疫组化 A细胞 B细胞 ) NCF 3.斑点杂交（Dot blotting） 斑点杂交是将DNA或RNA样品变性后直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离，不能了解目的序列的长度。 4.Southern印迹杂交（S