福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达、纯化、 活性检测及晶体 - 生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（８）：２４２９ 福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达、纯化、 活性检测及晶体生长的初步研究 １ ２ １ １ １ 冯　舵 　 张　阔 　李倩倩 　韩翠晓 　高　伟 （１北京林业大学理学院／林木育种国家工程实验室　北京　１０００８３　２中国科学院生物物理所　北京　１００１０１） 摘要　Ｓｆ２５２３蛋白属于硫氧还蛋白过氧化物酶（Ｐｒｘ）家族，在有氧代谢过程中消除活性氧，起到 保护生命大分子的重要作用。通过构建原核表达体系，可溶性表达并纯化了Ｓｆ２５２３酶蛋白，并对 蛋白进行了过氧化物酶活性检测，证明其依然具有天然活性，酶的核心结构并未发生变化。由分 子排阻色谱结果发现，酶蛋白体内和体外聚集状态不同，离体蛋白聚集状态不稳定，趋于二体化。 将纯化的单体蛋白即时进行了结晶实验，初筛长出了针状晶体。通过进一步切除标签蛋白进行 优化处理，最终得到了均匀的三维单晶。 关键词　硫氧还蛋白过氧化物酶　蛋白纯化　酶活性　晶体生长　福氏志贺痢疾杆菌 中图分类号　Ｑ７８９ 　　活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ），是需氧细胞 ５０位半胱氨酸残基形成分子内二硫键，通过硫氧还蛋 代谢过程中产生的活性氧簇，对细胞的核酸、蛋白质以 白作为氢供体，进行氧化还原反应（２Ｒ′ＳＨ＋ＲＯＯＨ＝ ［１］ 及脂质等生物大分子产生氧化损伤 。为了维持胞内 Ｒ′ＳＳＲ′＋ＨＯ＋ＲＯＨ）以消除代谢产生的过氧化物， ２ 低水平的ＲＯＳ，生物体在进化过程中，产生了诸多抗氧 从而在抗氧化损伤机制中起到重要作用。 化系统。硫氧还蛋白过氧化物酶家族（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ， 　　福氏志贺菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属于革兰氏阴性菌，兼性厌 Ｐｒｘ）就是比较重要的一类抗氧化蛋白，广泛存在于真细 氧，不形成孢子，可感染人类及灵长类动物，是细菌性 菌、古生菌、酵母、藻类、高等植物以及哺乳动物中，具 ［６］ 痢疾的主要病原菌之一。据ＷＨＯ简报 称，该致病菌 ［２３］ 有高度保守结构域的同系物达一百多种 。与其他 每年在世界范围内造成 １．６４７亿人感染，１１０万人死 氧化物酶不同，过氧化物还原酶利用活性半胱氨酸残 亡，大部分为发展中国家５岁以下的儿童。目前临床 基进行生化反应，而不是辅基或者金属离子等氧化还 分离菌株有９５％以上对多种抗生素出现抗药性，原有 原辅因子［４］。依据不同的催化机制，Ｐｒｘ蛋白被细分成 ［５］ 的疫苗也不理想，从而使得目前有效防治痢疾的手段 三类：典型２ｃｙｓ、非典型２ｃｙｓ以及１ｃｙｓ型 。本文的 严重匮乏，因此，ＷＨＯ也已经把研制志贺菌新型疫苗 研究对象是存在于福氏志贺痢疾杆菌２ａ型３０１菌株中 作为一项重要的工作。本文主要对Ｓｆ２５２３蛋白进行了 的硫氧还蛋白过氧化物酶（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔｈｉｏｌ 基因克隆、表达纯化、催化活性检测以及初步结晶学性 ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，简称 Ｓｆ２５２３），属于 Ｐｒｘ家族 中的 Ｂｃｐ