免疫共沉淀与western blot.pdf

免疫共沉淀与Western Blot 实验步骤: 1．以60mm 细胞培养皿为例，细胞转染后24 －36 小时后，吸净培养液 （可用PBS 小心漂洗一次）。 2 ．加入500μl 预冷的1×lysis buffer, 于4 ℃或冰上放置裂解细胞5 分钟。 3 ．将细胞裂解液转移到1.5 ml eppondorf 管内，于冷冻离心机4 ℃，13000 g 离心30 分钟。 4 ．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer, 混 匀后于100℃煮10 分钟，做为总细胞裂解液 （total cell lysate ，TCL ）于－20 ℃ 保存，或取6 －10 μl 进行SDS－PAGE 电泳，Western blot 检测目的蛋白的表达 水平 （接第5 步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下： 1） 分A/G beads ：按每管 （一个免疫沉淀样品）加入5 μl Agrose A/G beads 及5 μl （1 μg ）抗体计算一次实验所用beads 及抗体的总量，将抗体和beads 混 合，补充lysis buffer （补充的lysis buffer 的量能使每管能均匀分配到50 μl beads 及抗体的混合物），将beads 及抗体的混合物按每管50 μl （含5 μl beads 及5 μl 抗 体）分配到1.5 ml Eppendorf 管中，再加入400 μl 1×lysis buffer，备用； 2 ）从步骤4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步（步骤 1））已分好的beads 中，使终体积达到850 μl，将管子固定到混匀器上使混匀器 匀速旋转 （15 rpm ）免疫沉淀3 小时； 3 ） 将免疫沉淀后的溶液于4 ℃ 3000 rpm 离心3 分钟，去上清，加入 500μl 1×lysis buffer 洗涤 beads ，于冷冻离心机4 ℃3000 rpm 离心3 分钟，弃上清，共 洗涤三次。 4 ）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads ，加入35 μl 1×lysis buffer 与 等体积 2×SDS sample buffer 混合，于100℃煮沸10 分钟，稍离心后取10μl 左右 上样到PAGE 胶，进行电泳，或－20 ℃冻存。 5 ．电泳完毕，取下PAGE 胶，与PVDF 膜做成三明治形状，用湿转法进行电转1 小时。 6 ．电转完毕，取下PVDF 膜，加入5 ％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡 （75 rpm ）封闭 1 小时以消除非特异背景。 7 ． 封闭完毕，用 TBST 洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育 （75 rpm ）1 小时，使一抗与特异蛋白结合。 8． 回收一抗，用TBST 洗3 次 （75 rpm ），每次5－10 分钟。 9 ． 加入二抗，于脱色摇床孵育1 小时，使二抗与一抗结合。 10．用TBST 洗3 次，每次5－10 分钟。 11．将ECL A 液和ECLB 液各 1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF 膜30 秒，将 PVDF 膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X 光胶片曝光。 12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker 便于分 析。 注：如只做Western Blot ，跳过步骤4 即可。 实验试剂： 1．PBS ： NaCl 20mM, KCL 2.68mM, Na HPO 10mM, KH PO 1.76mM (pH7.4)，室温保 2 4 2 4 存。 2 ．1×lysis buffer： Tris-HCl 20 mmol/L(pH7.5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 1%, Sodium pyrophosphate 2.5 mM, β-Glycerrophosphate 1 mM, NaVO4 1 mM, Leupeptin 1 ug/ml, －20 ℃保存。（稀释成1