反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用.pdf

( ) 第 32 卷 分析化学 FENXI HUAXUE 　评述与进展 第 2 期 　　　 　　　　　　　　 　　　　　 　　　　　　 2004 年 2 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 248～254 反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用 朱晓囡　苏志国 ( 中国科学院过程工程研究所 ,生化工程国家重点实验室 ,北京 100080) 摘 　要 　反相液相色谱是一种以疏水作用为基础的色谱分离模式 。由于它具有分辨率高 、重复性好 、回收率 高等优点 ,在蛋白质及多肽的分离分析中得到了极为广泛的应用 。本文简要介绍了反相液相色谱及其分离机 理 ,对其在蛋白质和多肽研究中的应用如分离纯化 、肽图分析 、酶活测定 、构象变化检测及疏水作用研究等作 系统综述 ,并展望了反相液相色谱在这一领域的发展前景 。 关键词 　反相液相色谱 ,蛋白质 ,多肽 ,纯化 ,分析 ,评述 1 　引　　言 20 世纪 80 年代以来 ,随着生命科学研究的不断深入 ,用于多肽及蛋白质分离纯化的色谱方法得到 了很大发展 。其中 ,反相液相色谱由于具有许多其它色谱方法不可比拟的优势 ,正受到人们的关注 。它 能有效地分离各种多肽混合物 ,特别适用于分子量不大的蛋白质和多肽物质的分离 、纯化和鉴定 ,在蛋 白质及多肽研究中已得到了广泛的应用 。 近年来 ,随着基因组和蛋白质组计划的实施 ,对不同蛋白质的快速分析 、定性以及定量的需求更大 , 反相液相色谱以其快速简便 、灵敏度高 、重复性好 、分辨率高等优势受到人们的重视 , 已成为一种常备的 不可缺少的分析手段 ,并用于多肽药物分离中。反相液相色谱与各种质谱技术的结合也已成为蛋白质 结构分析的重要手段和发展方向。 2 　反相液相色谱 2 . 1 　简介 ( ) 反相液相色谱 reversephase liquid chromatography , RPLC 是 目前液相色谱分离中使用最为广泛的一 ( 种模式 ,它的特点是固定相的极性比流动相弱 。与它相对应的是正相液相色谱或极性相液相色谱 nor malphase liquid chromatography) ,如硅胶 、氧化铝或离子交换等极性介质为固定相的色谱 ,其中流动相的 极性低于固定相 。由于 RPLC 固相载体的疏水性 ,它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同 而发生强弱不同的相互作用 ,从而使不同分子在反相柱中彼此分离 。疏水性较弱的样品分子和固定相 间的相互作用较弱 ,因此较快流出;反之 ,疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用 ,在柱 内保留时间相对较长[ 1] 。RPLC 在 20 世纪 50 年代就已用于许多有机小分子的分离和分析 ,80 年代后逐 步应用于生物大分子如蛋白质 、多肽 、核酸的鉴定 ,并用于制备规模的分离[2 ] 。 RPLC 与其它色谱方法相比具有分辨率和回收率高 、重复性好 、操作简便等优势 。由于 RPLC 可使 ( ) ( ) 用挥发性体系如水溶三氟乙酸 TFA 乙腈 ACN ,纯化产物不必进行脱盐 , 因此 ,可大大简化操作步骤 。 另外 ,在其它模式的色谱中 ,保留时间主要决定于天然蛋白质分子表面的某些基团与固定相配基间的相 互作用 。而在 RPLC 中 ,蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠 , 内部某些疏水残基暴露并 与固定相相互作用 ,从而表现出与其它色谱及电泳方法不同的选择性 ,提供其它方法不能提供的信息 , 这成为 RPLC 在蛋白质及多肽分离分析中的又一个有利因素[3 ] 。由于以上种种原因 ,RPLC