酵母双杂交系统的发展和应用随着对多种重要生物的大 - 中国试剂网.pdfVIP

中国试剂网 3.26.5 酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一 个新的时代功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能 加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA 合 成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均 涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核 酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相 互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式 生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间 的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏 度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以 用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基 因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。 本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起 始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录 因子GAL4 在结构上是组件式的（modular ），往往由两个或两个以上结构上可以 分开，功能上相互独立的结构域（domain ）构成，其中有DNA 结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD ）。这 两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两 者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的 GAL4 转录因子活 性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS ）的下游启动子， 使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码 DNA-BD 的基因与已知蛋白质Bait protein 的基因构 建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait protein 。将编码 AD 的基因和 cDNA 文库的基因构建在 AD-LIBRARY 表达载体上。同时将上述 两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4，又不能合成 LEU 、TRP 、HIS 、ADE ，因此，酵母在缺乏这些营养的培 中国试剂网 3.26.5 养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能 重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因 HIS 、ADE 、LACZ 、 MEL1 ，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株 中的AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序 和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文 库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和 位点。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱 饵，在选定的 cDNA 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性 酵母菌株中可以分离得到 AD-LIBRARY 载体，并从载体中进一步克隆得到随机 插入的 cDNA 片段，并对该片段的编码序列在 GENEBANK 中进行比较，研究 与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多 个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender 等人以神经末 端蛋白 alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3 为操作平台，从成人脑 cDNA 文库中发