知识04 大肠杆菌感受态制备.pptVIP

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2017-09-08 发布于湖北
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知识04 大肠杆菌感受态制备.ppt

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知识04 大肠杆菌感受态制备

实验四大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法） * 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论 * 实验目的学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。 * 实验原理用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。 * 快速生长的DH5α经低温处理（0℃）置于低渗的0.1M/L CaCl2中，会造成细胞膨胀，同时，Ca会是细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。 * 实验仪器、材料与试剂（一）仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器 * 恒温摇床 * 灭菌锅 * （二）材料大肠杆菌DH 5α。 * （三）试剂 1. LB液体培养基 2. 0.1mol/L CaCl2溶液 * 实验步骤 1. 挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养14hr。 2. 取1mL菌液加入100ml LB液体培养基中，扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。 3. 菌液冰上放置10min，无菌条件下移入预冷的50ml Beckman离心管中，4℃，4000 rpm，离心5min。 * 4. 弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2 (0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置5min。 5. 4℃，4000 rpm离心5min。 6. 弃上清，用1.5 ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200μL/份分装到预冷的无菌Ep 管中，4℃保存备用。（入15%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。 * 实验结果与讨论感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。 *