关于2 蛋白质的基本机构和功能.ppt

1. 紫外分光光度法: 280nm, 0.1-0.5mg/ml (样品含核酸时)蛋白质(mg/ml)=1.55A280-0.75A260 2. 福林-酚试剂法: 碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色 范围:25-250μg(Tyr,Trp的反应) 七、蛋白质的含量测定 * 3. Biuret法： 蛋白质+碱性+Cu2++BCA试剂(4,4‘-二羧酸-2,2’-二喹啉钠)→紫色(562nm) 范围:10-1200μg/ml 4. Bradford蛋白分析法: 考马斯亮蓝G-250+乙醇+酸性→淡红色+蛋白质→蓝色(595nm) 范围:10-100μg/ml * 5.双缩脲法 肽键+碱性+Cu2+→紫红色 范围:0.5-10mg/ml 6.凯氏定氮法 1g氮相当于样品含有6.25g蛋白质 * 第四节 蛋白质的分离纯化 * 一、蛋白质的提取 1. 选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便 2. 组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白 物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等 化学法：如EDTA、SDS等 酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等） 3. 提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数 * 二、蛋白质的分离纯化 （一）根据溶解度不同 1. 等电点沉淀:蛋白质在pI时溶解度最小 2. 盐析(分级):大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀.各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同. 3. 低温有机溶剂沉淀(分级):降低水的介电常数 * （二）根据分子大小不同 1. 透析和超滤(分级):根据分子量的大小，用透析袋或滤膜将大、小分子物质分开 2. 凝胶过滤(分子排阻层析):又称分子筛，柱内填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖 3. 密度梯度离心:根据粒子密度差进行分离。蔗糖,CsCl * (三)根据电离性质不同 1.电泳法:蛋白质泳动的方向和速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及质点的大小和形状 1)醋酸纤维素薄膜电泳 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 3)等电聚焦电泳 4)免疫电泳 2.离子交换层析（如下页图） 1)离子交换纤维素 2)离子交换凝胶 3)大孔型离子交换树脂 * * (四)根据配基特异性 亲和层析: 根据生物大分子与其配基间特异的亲和结合(可逆) 如Ag-Ab、蛋白A与其补体、酶与其底物或抑制剂、互补的核酸链间等 * * 三、蛋白质的纯度鉴定 1.层析法:单一洗脱峰→层析纯(HPLC) 2.电泳法:单一区带→电泳纯 高效毛细管电泳(HPCE) 3.免疫化学法:→免疫纯 放射免疫分析法(RIA) 酶标记免疫分析法(EIA) * 半饱和硫酸铵 离心 球蛋白沉淀 血清 血清 离心 饱和硫酸铵 白蛋白沉淀 不同浓度硫酸铵对血清的盐析结果 返 回 * 分子筛层析原理示意图 * 返 回 * 密度梯度离心示意图 返 回 * * 把 二十種胺基酸編在虛擬的台北市地下鐵系統中，依其側基的特性分布在各條線路上，主要目的是要清楚表達各種胺基酸的特性，因為以後在蛋白質中的腳色很重要。 請特別注意，這只是虛擬的構造相關圖，並非代謝路徑。 一定要把胺基酸的中英文名稱、兩種縮寫法、分子構造等，努力背起來，絕對有益於你未來的學習與發展。依照上面各路線的分類來背，比較合乎邏輯，並且容易記憶。  （1） α-螺旋 * α-螺旋的结构特点 ①多肽链以肽键平面为单位，α-碳原子为 转折点，有规律的盘绕成右手螺旋结构。 ②每3.6个氨基酸残基盘绕一圈，螺距为0.54 nm。 ③相邻螺旋的肽键之间形成氢键，方向与长 轴基本平行，维持螺旋的稳定。 ④R基团伸向螺旋外侧，其大小、形状及电荷性质均影响α-螺旋的形成。 * （2）β-折叠 * β-折叠的结构特点 ①多肽链呈伸展状态，肽键平面沿长轴折叠呈 锯齿状，两平面间夹角为110°，R基交替地伸向锯 齿状结构的上下方。 ②若干肽段互相靠拢，平行排列，通过氢键连 接。氢键的方向与长轴垂直。 ③若两条肽段走向一致（N端、C端方向相同） ，称为顺向平行；反之，称之为逆向平行，逆向更 稳定。  * β-折叠包括平行式和反平行式两种类型 * （3）β-转角 * β-转角的特点 ①主链骨架本身以大约180°回折 ②回折部分通常由4个氨基酸残基构成 ③构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的- NH 基之间形成氢键来维系。  * （4）无规卷曲 是指多肽链中除了以上几种比较规则 的构象外，其余没有确定规律性的那部分 肽链构象