原核注射-中国细胞生物学学会.PDF

原核注射  一、 试剂耗材  1. 手术器械  眼科镊（有齿，无齿）  显微镊（一对）  眼科剪  缝合线  缝合针  组织夹  2. Olympus 倒置显微镜  3. Eppendorf 操作手臂  4. P‐87 拉针仪  5. MF‐900  断针仪  6. 试剂        M2              Sigma M7292  M16             Sigma M7167            矿物油           Sigma M5310            注射缓冲液        Millypore MR‐095‐F            透明质酸酶       sigma H3506 (500IU/ml diluted in M2)             阿佛丁           Sigma T48402  7. 注射针（GD‐1，narishige）     自制  固定针（国产）              自制  Microloader                  Eppendorf NO.5242 956.003  8. 供受体小鼠  供体雌、雄鼠      C57BL/6J    ( ♀3~4weeks,  ♂8weeks)  假孕雌鼠           B6CBF1 (C57BL/6J ♀*CBA ♂)    8weeks  结扎雄鼠          B6CBF1 (C57BL/6J ♀*CBA ♂)     8weeks                               二、 结扎雄鼠  · B6CBF1 雄鼠麻醉（1.25%阿佛丁，腹腔注射）  · 腹部向上呈仰卧状，剪净手术部位鼠毛，70%酒精消毒下腹部 · 剪开皮肤、肌肉层，切口长约1cm。单侧体壁开口处穿入缝合线，便于后 期找到肌肉层。 · 结扎输精管：用钝头镊子夹住脂肪垫轻轻拉出睾丸、附睾和输精管。 鉴别输精管：输精管连接附睾和阴茎。输精管富含纵向分布的血管， 用剪刀或镊子使输精管与周围组织游离。用镊子夹起输精管成一个环，酒精 灯加热另一钝头镊子至变成红色，用红热的镊子夹紧输精管环使之与输精管 分离，并形成两个封闭末端。分开烧焦的两端，用钝头镊子将整个器官送回 腹腔内。 · 重复上述步骤切断另一侧输精管。 · 缝合肌肉层及皮肤切口。 · 术后监护：监察小鼠直至完全复苏，如果发现有明显的疼痛、不安或术 后反应，应给予安乐死。复苏后的一周内应每天观察小鼠是否有感染或 其它问题，一经发现，应给予安乐死。   三、 原核注射  1．激素配置方法  · PMSG :将PMSG 冻干粉溶于0.9%NaCl无菌生理盐水,浓度50IU/ml，根 据实验需要的量分装到 1.5mlEP 管中（每管可分装 5 只或 10 只小鼠 的用量），每只小鼠剂量为 0.1ml（5IU）。－20℃至少可保存一个月。 · HCG :将冻干粉溶于0.9%NaCl无菌生理盐水,浓度50IU/ml，根据实验 需要的量分装到1.5mlEP管中（每管可分装5只或10只小鼠的用量）， 每只小鼠剂量为0.1ml（5IU）。－20℃至少可保存一个月。 超数排卵流程：  周一  周二  周三  周四  周五  周六  周日  PMSG    HCG  检栓/注射          PMSG    HCG  检 栓 / 注     射