应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87基因功能的初步研究.pdfVIP

第 l5卷 第 1期 寄生虫与医学昆虫学报 Vo1．15．No．1 2008年3月 Acta Parasito1．Med．Entomo1．Sin Mar．，2008 应用RNA干扰技术对旋毛虫Ts87 基因功能的初步研究 郝 冉 杨雅平 杨 静 王少华 诸欣平 (首都医科大学基础医学院寄生虫学教研室，北京 100069) 摘要 为研究旋毛虫Ts87基因的功能，通过RNA干扰途径抑制目的基因的表达。针对 ％87基因序列设计 并合成特异性dsRNA、siRNA，通过浸泡方式分别将 dsRNA、siRNA导人肌幼虫体内，利用实时荧光定量 PCR分析％87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达。此外，测定RNA干扰作用下的肌幼虫体外存活率的 变化。根据实时荧光定量PCR结果，dsRNA及siRNA均能有效抑制 ％87基因 mRNA的表达。此外，两种 RNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率。实验表明，RNA干扰技术能够有效抑制旋毛虫功能基因 ％87表达，从而为研究旋毛虫基因的功能提供一种新的有效途径。 关键词 RNA干扰；小干扰 RNA；dsRNA；旋毛虫；Ts87基因 RNA干扰 (RNA interference，RNAi)是一种 培养，难以获得大量全虫抗原，阻碍了其疫苗研 真核生物体内的基因调控机制，是在真核生物体 制。随着基因重组技术的发展，由基因重组抗原 内由双链RNA(Double—stranded RNA，dsRNA)介 制备的疫苗在其他寄生虫病的免疫预防上取得很 导体内基因同源序列降解的现象，这是一种转录 大进步 (Ghosh et a1．，1996；朱荫昌等，2002)。 后水 平 的基 因沉 默 (Post．transcriptional gene 因此，利用基因工程手段研究其功能基因并获取 silence，PTGS) (Hamilton and Baulcombe，1 999)， 或制备有效的疫苗候选抗原分子一直是人们研究 也称RNA沉默 (RNA silence)。RNAi的主要过程 的热点。本课题组通过分子生物学方法从旋毛虫 是dsRNA被核酸酶切割成21～25 nt的干扰性小 cDNA表达文库中筛选得到Ts87抗原新基因，并 分 子 RNA (Small interference RNA，siRNA) 且证实Ts87基因具有良好的免疫保护性 (杨雅 (Tuschl et a1．，1999；Hammond，et a1．，2000； 平等，2002；杨静等，2003；诸欣平等，2003)。 zamore etⅡz．，2000)，siRNA是RNA干扰作用的 本实验将该基因特异性dsRNA及siRNA，分别通 中间效应分子，可以与蛋白结合形成RNA诱导 过浸泡方式导入旋毛虫肌幼虫的体内，观察2种 的沉默复合体 (RNA induced silencing complex， RNA对于Ts87基因产生的干扰效果以及对肌幼 RISC)，识别并靶向切割同源性靶 mRNA分子， 虫体外存活率的影响，从而对Ts87基因功能进 使mRNA分子降解，基因沉默出现 (Bernstein et 行初步研究。 。Z．，2001a)。RNAi具有高度的序列专一性，能 使特定基因功能丧失，从而确定其功能，因此广 1 材料与方法 泛应用于功能基因组的研究。 旋毛形线虫 (Trichinella spiralis)可感染人 1．1 试剂 及 150多种动物，引起的旋毛虫病是一种人兽共 DNA marker及限制性内切酶均购自Takara生 患寄生虫病，严重危害人类健康和畜牧业生产。 物有限公司；逆转录试剂盒 (QuantiTect Revere 由于旋毛虫病的诊断比较困难，因而对该病的预 Transcription kit)、荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒 防尤为重要。目前，由于旋毛虫不能在体外传代