第七章细胞融合与体细胞杂交.ppt

第七章 细胞融合与体细胞杂交 细胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。 对于植物也叫原生质体融合，亲本细胞是体细胞，也叫体细胞杂交（somatic cell hybridization）。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。 根据融合时细胞的完整程度 1)对称融合 即两个完整的细胞原生质体融合。 2)非对称融合 利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为三种情况： ①融合细胞=A细胞核+B细胞质 ②融合细胞=A细胞(核+质)+B细胞质 ③融合细胞=A细胞(核+质)+B细胞(部分核+质) 2.根据原生质体的融合方式 1）自发融合 2）诱导融合 1）自发融合 用酶法分解细胞壁后自发的进行融合。这类融合是种内融合，与胞间连丝有关，融合的个体一般不能进一步发育。 2）诱导融合 是指制备出原生质体后，加入诱导剂或用其他方法促使两个亲本原生质体融合，诱导融合可以是种内的，也可以是种间的，甚至是属间、科间的融合。 融合的过程，原理与关键 化学诱导融合方法 NaNO3法 高pH-高Ca2+法 PEG诱导融合法? （一）NaNO3法 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起。不足：诱导频率不高。 （二）高pH-高Ca2+法 用pH10.5的50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱发原生 质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。 物理诱导融合方法——电融合法 1.电融合法原理 2.电融合优点 第二节 植物体细胞杂交 体细胞杂交 两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触发生细胞融合并使之分化再生形成新品种的过程。 体细胞杂交的意义 实现远缘杂交，形成新的物种 创造细胞质杂种—核外遗传系统 培育作物新种质和新品种 植物体细胞杂交的过程 1.亲本选择 2.原生质体的制备 3.原生质体融合 4.融合（杂种）细胞筛选（关键） 5.细胞壁再生 6.分裂形成细胞团--愈伤组织 7.杂种植株的再生与鉴定 杂种细胞筛选方式 1.抗药性筛选法 2.营养互补筛选法 3.物理特性筛选法 4.荧光标记法 1.抗药性筛选法 利用细胞对药物敏感性的差异筛选融合细胞，教材P71。 2.营养互补筛选法 根据双亲原生质体对营养的要求不同而建立的方法。 例如，Glimelius等用突变位点不同的烟草硝酸还原酶缺失培养基进行选择。 突变体由于缺乏正常的硝酸还原酶而不能在该培养基上生长；而杂种细胞由于两个突变体的互补作用，产生的体细胞杂种恢复了正常硝酸还原酶活性，因此只在有硝酸盐的培养基上正常生长。 3.根据物理特性筛选 利用细胞在形态、大小、颜色上的差别可以在倒置显微镜下用微管将融合细胞吸取挑选出来。 4.荧光标记法 其它杂种细胞筛选方式 突变互补筛选 1）隐性突变互补筛选 2）显性抗性互补筛选 3）隐性突变和野生型互补筛选 4）显-隐性双突变体筛选 1）隐性突变互补筛选 亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，能正常生长。 2）显性抗性互补筛选 亲本1：抗5－MT（5－甲基色氨酸） 亲本2：抗S－氨乙基半胱氨酸 杂种细胞能在含有5－MT和S－氨乙基半胱氨酸培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡。 六、体细胞杂种植物的鉴定 1.形态鉴定 2.细胞学鉴定 3.生化鉴定 4.分子鉴定 1.形态鉴定 比较再生植株与融合亲本在形态上的异同，在同一形状上同时带有双亲的特点，但可能杂种植物的形态倾向某一亲本。 2.细胞学鉴定 典型情况下，杂种细胞的染色体数目为双亲数目之和。 极端情况下，一个亲本的染色体全部被淘汰。 最常见的情况是形成非整倍体。 非对称融合的杂种细胞中,从数目上不能表现出来,可以采用染色体分带技术处理。 3.生化鉴定 同工酶图谱鉴定： 杂种细胞图谱有三种情况：a.双亲酶带的总和；b. 双亲的部分酶带；c.出现新的杂种带。 4.DNA分子标记鉴定 RFLP（限制性片段长度多态性）鉴定、RAPD（随机扩增多态性DNA）标记鉴定。即可用于对称杂种鉴定，又可鉴定非对称杂种。其中RAPD特别适合杂种细胞的鉴定。 七、体细胞杂种的遗传特性 1.细胞分裂与染色体丢失 2.基因转移与性状表达 3.体细胞杂种遗传上的不稳定性 八、体细胞杂交