北京协和医院中心实验室实验指南细胞培养流程秦伟.PDFVIP

北京协和医院中心实验室实验指南 细胞培养流程 秦伟 2012-12-28 目的及应用： 用于细胞传代 试剂及设备： 培养基，0.25%胰酶，75%酒精，95%酒精，细胞培养箱，超净台，手套，酒精灯， 吸管，移液管（5ml，10ml），50mL 离心管，培养瓶（25cm2 ），移液枪，离心机， 计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱 实验原理： 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细 胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验 的必经过程。 实验步骤： 以Hela 细胞为例说明具体实验操作步骤： 一．实验前准备工作 进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒 精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL 离心管、移 液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃ 水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。 二．准备实验 北京协和医院中心实验室实验指南 先关闭紫外灯30min 后再进行实验；75%酒精喷于纱布上，将超净工作台仔细擦试 干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。 1．吸除旧的DMEM 培养液： 拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧 灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM 培养液，将用后 的吸管弃于废弃缸里。注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。 2 ．消化： 拿出5mL 移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养 瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min 。取下用后的移液管。 3 ．中和： 从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL 灭菌后移液 管加入3mL DMEM 培养液终止消化。反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL 离 心管中。 4 ．离心收集细胞： 配平后离心200×g，3min 。将新的DMEM 培养液加入新培养瓶中，2mL ／瓶（培 养瓶底面积为25cm2 ）。 5 ．重悬细胞： 离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。加入新 DMEM 培养液（按2mL ／瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复 吹打使细胞充分混匀，要尽量减少产生气泡。 6.分装： 混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞 名称，培养液，细胞传代数，传代日期，实验人员。 7 ．培养： 将细胞放于37℃，5% CO2 细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放 于4 ℃冰箱中保存。 8．清洁超净台 实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。 北京协和医院中心实验室实验指南 9 ．观察： 每天观察细胞，并记录细胞生长状态。 注意事项： 1．紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小 时后再进入。 2 ．所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一 步都要注意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶 口微微翘起。 3 ．细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速 不能太高，实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在 显微镜下观察细胞是一个一个的。 4 ．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近 酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用 液应严格分开。 5 ．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光 性好，生长致密时即可传代。