半干式蛋白质电泳印迹的影晌因素及条件优化.PDFVIP

细胞生物学杂志 Chinese Journal ofCell Biology 2007 , 29: 299-302 半干式蛋白质电泳印迹的影晌因素及条件优化 刘彬韩梅*温进坤 (河北医科大学基础医学研究所，河北省医学生物技术重点实验室，石家庄050017) 摘要 采用蛋白质分子量标准物和纯化的重组蛋白质进行半干式蛋白质印迹，探讨半干式 电泳印边的多种因素对印迹效果的影响。结果表明:在不同电转移条件下，均存在不同程度的蛋白 质透膜转移现象，当电流强度恒定时，也转移时间过长和上样量过大是造成实验中透膜转移而丢失 的主要原因，可根据待测蛋白质的分子量和表达丰度确定恰当的电转移时间和上样量。 关键词 半干式电转移;蛋白质;免疫印迹 1979 年， Towbin 等[1] 首次报道了将蛋白质从电 1.3 方法 泳凝胶转移到硝酸纤维素膜(NC 膜)的技术。后来 将蛋白质分子量标准物与纯化的 GST-SM22 融 Kyhse-Anderse[2]创立了半干式蛋白质转移的方法，使 合蛋白上样进行十二酷基硫酸铀一聚丙烯酷肢凝胶 蛋白质印迹的整个过程变得高效而且迅速。随着这 电泳(SDS)，凝胶浓度为 8%。电泳完毕后对 一技术在生物研究领域的广泛应用，电泳印迹过程中 凝胶进行半干转膜(转膜缓冲液为 48 mmol/L Tris , 39 的一些影响因素逐渐得到了大家的关注[3刑。电泳印 mmolι甘氨酸，1.3mmolιSDS，含20% 甲醇， pH 9.2) 。 迹的效果如何直接影响到下一步抗体检测真实性，以 半干式转膜槽阴极在上，阳极在下，在半干转移的凝 往通常对湿转后印迹膜的蛋白质转移情况用丽春红 胶三明治中，先准备阳极侧滤纸，然后重叠放置 染色进行初步观察后再继续进行抗体检测[61 ，然而在 两张大小完全一致的0.2μmPVDF 膜，再铺凝胶及 半干式蛋白质转移方面的应用未见报道。我们采用 阴极侧滤纸，缓冲液为连续缓冲液，蛋白质移动方向 丽春红染色的方法对半干式蛋白质电泳印迹至聚偏 由上而下。转移电流50-250 mA，转移时间 15-50 氟乙烯膜(PVDF 膜)上的蛋白质进行预检测，并对导 min 。电转移结束后，用丽春红直接染色对印迹至 致蛋白质透膜转移的几种影响因素进行了观察与比 PVDF 膜上的蛋白质转移情况进行检测。 较，为选择合适的电转移条件提出一些建议和策略。 2 结果与讨论 1 材料与方法 2.1 电转移中蛋白质存在转移过度现象 1. 1 材料 图 1 显示的是对GST-SM22 融合蛋白进行印迹 丙烯酷胶(acrylamide) 、甲叉双丙烯酿胶(bisa­ 后丽春红染色的结果。由图可见，直接与凝胶接触 crylamide)为Sigma公司产品，丽春红(分析纯)购自北