基于模块组织工程方法构建不同形状工程化组织.docVIP

　　基于模块组织工程方法构建不同形状工程化组织 第1章绪论 1.1组织工程概述 组织工程是将工程和生命科学相关的原理及方法，应用于了解不同组织中结构和功能的相互关系，同时又致力于开发生物基质以修复、维持并提高组织各项功能的一门学科⑴。组织工程是利用生物替代品来促进组织的修复和再生，因此它能解决病损组织的修复和坏死器官的移植短缺问题[2]。组织工程的具体方法是先将组织中的细胞进行体外分离、扩增，然后将分离的到的一定量的细胞接种到生物相容性良好并可生物降解的生物支架材料中，待细胞在生物支架中贴附、生长、增殖并均勾分布于各区域后，将细胞与支架的复合物植入体内相应组织的受损部位，来进行受损组织的修复。随着时间的延长，生物材料逐渐被机体降解吸收，细胞在此过程中形成在形态和功能上与受损组织或器官相一致的组织替代物，从而达到修复创伤和重建功能的目的。 1.2组织工程研究 内容组织工程是包含工程学和生命科学的基本原理、技术和方法的一门综合性学科，其目的是在体外构建一个有生物活性的组织替代物，并且植入体内后可以修复缺损组织，起到替代组织或器官功能的作用[3，4]。组织工程的研究内容主要包括三个方面：种子细胞、支架材料和体外构建技术。种子细胞按其取材的不同主要分为三种：自体、同种异体和异种[5]。自体组织的细胞就是从自身健康组织中分离获得的细胞，它是很好的种子细胞，不存在免疫排斥反应，但是它存在有限、取材及分离困难、会对自身健康组织造成损伤等局限性，因而限制了其在组织工程领域的应用。同种异体组织的细胞是取自与受损组织同一种属但不是同体组织的细胞，这种的细胞有较弱的免疫排斥反应，但也存在着供体不足、可能引发伦理道德等方面的争议的局限性，因此其应用也受到一定程度的限制。异种组织的细胞是取自与受损组织不同种属的细胞，其广泛，存在供体充足、取材容易等优点，但由于其免疫排斥反应较强而难以用于缺损组织的修复。因此目前获得足够数量、纯度高、不存在免疫排斥反应、增殖能力较强的种子细胞是组织工程研究与应用的关键之一。种子细胞按其自身性质的不同主要分为三种：成熟体细胞、干细胞和其它种类的细胞。 第2章灌注培养时间对工程化组织构建的影响 2.1前言 由于传统的top-do-up技术进行组织构建。本实验室在前期研究中提出了釆用微组织组装构建大尺寸工程化组织的微构重塑技术新思想，并证明了其可行性。在此基础上，Mei等[57]釆用微构重塑技术，以成纤维细胞为模型细胞和Cultispher-S微载体为微型三维支架，系统地研究了在微组织制备过程中操作参数对微组织聚团的影响，并将制备的微组织通过7 d的灌注培养，形成了直径为14 mm、高7 mm的工程化组织。Chen等利用羊膜间充质干细胞和Cultispher-S微载体，采用了两阶段培养法制备了微组织，将成骨诱导后的微组织置于反应器中进行灌注培养，7d后可形成直径20 mm、高10 mm的工程化骨组织。上述研究优化了微构重塑技术的第一步一一微组织构建过程，制备的微组织细胞密度高、活性好、细胞和胞外基质分布均匀，同时也证明了釆用微构重塑技术可以制备厘米尺寸的工程化大组织，进一步通过扩增、诱导两步法，可以实现基于间充质干细胞的工程化骨组织的体外构建。然而，通过7d的灌注培养，虽然可以形成结构完整的厘米级尺寸的工程化组织，但构建的组织内部结构松散，在取样进行分析时，经常有微组织散落，因此需要对微构重塑技术的第二步工程化组织组装进行研究，以获得内外结构完整、细胞密度高、活性好、细胞和胞外基质分布均匀的大型工程化组织。 2.2材料与方法 本实验所釆用的是成纤维细胞（human fibroblast，HF),取自新生儿包皮，其分离方法按照文献中所述。取健康小儿手术切除的新鲜包皮，将获得的包皮剪成5 cm2左右大小的组织块，然后在75%乙醇中冲洗消毒30 s，再在含有双抗的PBS中漂洗，以清除残留在包皮上的血块等物质。漂洗后，用眼科手术剪剪去包皮内部多余的脂肪组织，然后将包皮放入含0.25%中性蛋白酶（Dispase，Gibco)的DMEM高糖培养基（Gibco)中，置4deg;C冰箱中静置消化过夜。取出消化过夜的组织块，用弯头镊子轻轻地将真皮和表皮分离。将真皮组织剪碎，碎片溶于0.25%胰蛋白酶（Gibco)溶液中，于37deg;C恒温振荡箱中消化2~4 h。将消化液用无菌的200目滤器过滤，滤去未消化的组织，并收集过滤后的细胞悬液体，1000 r/min离心5min,弃去上清液。加入含双抗（]()OU/mI硫酸链霉素和lOOU/ml青霉素钠）和10%新生牛血清（Neonatal Bovine Serum，NBS)的DMEM高糖培养基，用10 ml移液管轻轻吹勾细胞。细胞悬液转移至T-150方瓶中，置于37deg;C、5% CO2饱和湿度培