Restriction endonuclease enzyme digestion限制内切酶.docxVIP

前言：1950年科學家發現噬菌體 (λ phage) 對大腸桿菌的不同菌株 (strain) 具有不同的感染能力。1962年瑞士科學家Werner Arber等人證實E. coli K菌株可產生一種酵素能水解λ phage的DNA，因而稱為限制酵素。1970年科學家開始利用限制酵素來處理自細胞分離出的長條型DNA，以得到固定大小的特定DNA片段，可應用在基因組結構與重組DNA的研究。目的：將分離得到的質體DNA，以不同的限制酶切割，經agarose膠電泳分離DNA片段後，檢定質體圖譜或截切所需DNA片段，以進行重組質體DNA（recombinant plasmid DNA）之建構。載體DNA ：pBac-D-Pn539-E約7.2 Kb 與pET-21(+)約5.4 Kb ，分別以限制酶BamHI與EcoRI切割來檢定plasmid的正確性。原理：利用限制性內切酶切割DNA是DNA重組過程中的關鍵步驟之一。成功的酶切為後續工作提供了有效的實驗材料。限制性內切酶是細菌體內限制修飾系統內部切斷的內切酶。根據限制性內切酶的特性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。本實驗使用其中的Ⅱ型酶對DNA分子進行切割。 在酶切反應中，DNA的純度、緩衝液中的離子強度、Mg2+、pH值、作用濃度等因素均可影響反應，一般可通過增加酶的用量，延長反應時間等措施以達到完全酶切。限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）能將雙股DNA切開的酵素。切割方法是將糖類分子與磷酸之間的鍵結切斷，進而於兩條DNA鏈上各產生一個切口，且不破壞核苷酸與鹼基。切割形式有兩種，分別是可產生具有突出單股DNA的黏狀末端，以及末端平整無凸起的平滑末端。由於斷開的DNA片段可由另一種稱為DNA連接酶的酵素黏合，因此染色體或DNA上不同的限制片段，得以經由剪接作用而結合在一起。限制酵素的單位限制性內切酶的活性以酶的活性單位unit (U)表示，1個酶單位（Unit/ U）指的是在反應總體積為20μl，最適溫度條件下於一小時時間可將1μgDNA分解完全的限制酵素量。限制酶的命名?限制酶的命名是以該酶來源的原核生物的名稱爲依據，即酶的名稱的第一個大寫字母取自於屬名的第一個字母，第二、三個小寫字母取自於種名的前兩個字母，字母後面的羅馬字則是簡單地表明該種生物中不同限制酶分離的先後順序。?限制酶名稱的書寫方式，前三個字母常用斜體或加下橫線表示。例如，分離自產色鏈黴菌(Streptomyces achromogenes )的兩種限制酶被分別命名爲SacI和SacII。?若同一生物種內又分爲不同的血清型或菌株品系，其名稱則放在限制酶名稱的第三個字母之後。例如限制酶HincⅡ和HindⅢ則是分別來自流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的c和d血清型菌株。限制酶的種類已知的限制酶分為Type I、Type II與 Type III三類。Type I與Type III限制酶同時具有endonuclease與methylase的活性。Type I限制酶會隨機的切割距離辨識位置~1000 bp的序列，Type III則只會切割距離辨識位置24~26 bp的序列。Type II限制酶，則會專一地切割所辨識的核酸序列的位置，一般可辨識雙股DNA上特定的4~8個鹼基，並能在認知序列內的特定位點上切割雙股螺旋DNA。每一種限制酶能辨識一特定的DNA序列並加以切割，但它不會切割細菌自己的DNA，因為細菌 DNA 上的切割位置已被甲基化，稱為restriction-modification system。不同的細菌中可純化出具不同專一性的限制酵素，可用來做基因剪接時的「剪刀」，使其成為基因或分子遺傳操作上極為有用的工具，目前被廣泛應用於遺傳工程、基因選殖(cloning)和基因圖譜分析(gene mapping) 。第一型限制酶同時具有修飾(modification)及認知切割(restriction)的作用；另有認知(recognize)DNA上特定鹼基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距離認知位(recognition site)可達數千個鹼基之遠,並不能準確定位切割位點，所以並不常用。例如：EcoB、EcoK。第二型限制酶只具有認知切割的作用，修飾作用由其他酵素進行。所認知的位置多為短的迴文序列(palindrome sequence)；所剪切的鹼基序列通常即為所認知的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindIII。第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時具有修飾及認知切割的作用。可認知短的不對稱序列，切割位與認知序列約距24-26個鹼基對，並不能準確定位切割位點，所以並不常用。例如：EcoPI、HinfIII。第II型限制酶