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成 绩 硕士研究生课程论文 课程名称 基因表达与调控 提交时间 学号姓名 所在学院 任课教师 植物赤霉素20-氧化酶基因的克隆、表达和调控技术研究 摘要 目前，赤霉素（GA）生物合成研究最普遍的途径主要是编码生物合成酶基因的克隆以及GA缺陷和GA不敏感突变体的研究。主要包括内柯巴基焦磷酸合酶和内贝壳杉烯合酶的克隆；玉米中编码细胞色素P450的Dwarf-3基因的发现，尽管它的功能未知；GA20-氧化酶和3β-羟化酶基因的克隆。这些酶的cDNA和基因组克隆的可用性使得通过GA浓度被环境和内源性因子调控的机制得以在分子水平进行研究。揭示赤霉素20-氧化酶基因的分子特征, 通过转基因技术调控植物体内活性赤霉素的含量, 可为改良品种提供新的思路。本文从赤霉素20-氧化酶基因的克隆、表达调控及其在植物基因工程中的应用等方面进行了综述。 关键词 赤霉素20-氧化酶；基因克隆；表达调控；突变体 前言 生物活性的赤霉素控制着植物生长和发育的各个方面，包括种子发芽、茎的延伸、叶片扩大以及花和种子的发育。已从植物中鉴定出136种GA，其中只有少数具有生物活性[1]，如GA1、GA3、GA4和GA7等。因此，许多存在于植物中的无生物活性的GA作为生物活性形式或者失活代谢物的前体。 目前，已经通过一些途径鉴定出许多编码GA代谢的酶的基因，如从富含GA酶的植物中进行常规的酶纯化、cDNA表达文库的功能筛选或者在GA缺陷的矮化突变体中采用分子遗传途径。现在，在模式生物物种中基因组学工具的使用加速了涉及GA代谢途径的更多基因的鉴定。但是，我们对GA代谢相关基因研究仍然不足，一些编码酶的功能未知的基因刚刚被鉴定。 赤霉素的生物合成过程可分为3步: 第1步在质体中进行。由牦牛儿牦牛儿焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP) 在古巴焦磷酸合成酶(copal pyrophosphate synthase,CPS) 和内根-贝壳杉烯合成酶(ent-kaurene synthase,KS) 催化下环化为赤霉素的前身内根-贝壳杉烯(ent-kaurene)。第2步在内质网中进行。从内根贝壳杉烯氧化为GA12-醛(GA12-aldehyde) 。第3步在细胞质溶胶中进行。GA12 醛进一步氧化为不同的GAs。在植物里形成活性赤霉素主要有3条主要途径:早期3-羟基化途径( GA14→GA37→GA36→GA4→GA34)、早期13-羟基化途径( GA53→GA44→GA19→GA20→GA1→GA8) 和早期非13-羟基化途径( GA12→GA15→GA24→GA9→GA4→GA34) [3-4]。 关于赤霉素生物合成途径中赤霉素20(GA20)-氧化酶基因的研究取得了较大的进展, 在本文中，主要就这种酶基因的克隆、表达调控及其在植物基因工程中的应用等方面进行了综述,旨在揭示赤霉素20-氧化酶基因的分子特征,为通过转基因技术调控植物体内活性赤霉素的含量和改良品种提供新的思路。 1 GA20-氧化酶基因的克隆 在植物体中存在多个GA20-氧化酶基因,共同组成一个小基因家族,对植物茎的伸长、叶和花的伸展等生长发育起着关键性作用[5-6]。由GA20-氧化酶基因编码的GA20-氧化酶不断氧化GA12到GA9和GA12到GA20的C-20,把赤霉素C-20以二氧化碳的形式除去,使之形成具有生物活性的C-19形式的GAs。GA20-氧化酶是一种多功能酶,不仅是一种参与赤霉素生物合成的氧化酶, 而且是赤霉素生物合成过程中的关键限速酶, GA20-氧化酶控制着有生物活性的GA1和GA4的生物合成数量。 1. 1 GA20-氧化酶基因的分离 GA20-氧化酶基因已从许多植物中被分离鉴定。GA20-氧化酶基因的发现和研究最早是从南瓜GA20-氧化酶的纯化开始的。Lange等1994年利用蛋白质抗体技术,从南瓜胚乳表达文库中筛选出编码GA20-氧化酶的cDNA。基于南瓜GA20-氧化酶基因序列的发现, 以及克隆基因策略的不断发展,克隆其他物种的GA20-氧化酶基因成为可能。例如,在拟南芥中有5个GA20-氧化酶基因(AtGA20ox1-AtGA20ox5) 被分离出来, 其共同组成一个小基因家族[7]; 采用同源克隆结合BAC(bacterial artificial chromosome) 文库筛选的方法克隆了小麦中的GA20-氧化酶基因[8];