目基因分离与克隆.pptVIP

第四章?????? 目的基因的分离和克隆;第一节??????? 目的基因的获得;一、化学合成法 自动化 DNA合成仪;应用范围：1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因 ;二、建立基因组DNA文库;2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程 ） ⑴ 分离纯化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用 ②限制性内切酶降解（鸟枪法） 过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。 ;⑶ DNA片断与载体的连接包装 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体 酵母人工染色体 ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA——转化细菌 菌落 ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。; 基因组文库大小的计算 1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（ N ）的公式： In（1－P） N = ——————— In （1－f） P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。 例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？ In（1－0.99） N = ——————————————— = 9.2×106 In （1－1.5×103／3×109）;若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。;;四、构建cDNA文库 ;特点： cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操作更为方便。 mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特定功能基因工作量较小。 mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板。（转录特征） 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 不能研究基因组的结构功能 ;构建cDNA文库 1.制备mRNA 1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料 2)从总的RNA中分离mRNA 将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[ oligo(dT) ] 纤维素中进行亲和层析 ; 2.第一股 cDNA合成 1）以Oligo(dT) 为引物：从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成, 对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA 2）随机引物：以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA） 3.第二股cDNA的合成;⑴ 自身引导法： ⑵ 置换合成法 ⑶ 外加引物合成法 4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞 (如图4-5) ;筛选目的基因 ⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为探针 将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）;⑵ 免疫结合法 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩增, 提取DNA