目基因克隆.pptVIP

基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后， 或确定其表达调控机制和生物学功能， 或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞） 或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 ; 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。;A PCR法;使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是： 已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列， 根据该序列化学合成聚合反应所需的双引物 ;5‘; 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆 ;3. PCR盒式引物扩增法;B 基因文库的构建;基因文库的基本概念;基因文库的基本概念;基因文库的基本概念;基因文库的基本概念;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因组文库重组克隆的排序;基因组文库重组克隆的排序;酶切片段末端标记法;基因组文库重组克隆的排序;C cDNA法;cDNA法克隆目的基因的基本战略;cDNA第二链的合成 ;cDNA第二链的合成 ;cDNA第二链的合成 ;cDNA法克隆目的基因的基本战略;cDNA法分离目的基因的基本程序;cDNA法分离目的基因的基本程序;cDNA法分离目的基因的基本程序;cDNA法克隆目的基因的局限性;D 化学合成法;化学合成法的基本战略;化学合成法的基本战略;化学合成法的基本战略;化学合成法的基本战略;;;;;E 鸟枪法;”鸟枪法(Shotgun)”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况.;DNA的鸟枪法测序的主要步骤 ;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;鸟枪法操作的改进;鸟枪法操作的改进;鸟枪法操作的改进;透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。 ;低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65℃熔化胶，然后抽提回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。 ;玻璃珠洗脱法： 将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。;琼脂水解酶： 将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA ;鸟枪法克隆目的基因的局限性