人锰超氧化物歧化酶hsod2-q46k突变体的表达与 - 暨南大学学报.pdf

第３８卷 第３期 暨南大学学报（自然科学与医学版） Ｖｏｌ．３８　Ｎｏ．３ ２０１７年６月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ） Ｊｕｎ．　２０１７ 　 人锰超氧化物歧化酶ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ突变体的 表达与功能分析 １ １，２ １ １ １ 谢　臖 ，　牛得伟 ，　李艳冰 ，　高　可 ，　高　辉 ， １，２ １，２ １，２ 李帅广 ，　沈良华 ，　王　峰 （暨南大学 １．药学院基因组药物研究所； ２．中药药效物质基础及创新药物研究 广东省高校重点实验室，广东 广州５１０６３２） ［摘　要］　目的：构建人锰超氧化物歧化酶（ｈＳＯＤ２）Ｑ４６Ｋ突变体，简化获得ｈＳＯＤ２突变体的步骤，探讨ｈＳＯＤ２ 结构与功能的关系．方法：通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）体外定点突变技术将ｈＳＯＤ２的４６位Ｑ氨基酸突变为Ｋ氨 基酸，经测序鉴定正确后将ｐＥＴ１５ｂｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ突变体重组质粒转化 Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ大肠杆菌，通过异丙基Ｄ硫 β 代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导目的蛋白表达．利用ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬＷｏｒｋｓｐａｃｅ对ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ突变体进行同源建模，利用 ＳｗｉｓｓＰｄｂＶｉｅｗｅｒ软件对建模结果进行分析．利用ＮｉＮＴＡ亲和层析纯化目的蛋白后用超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）检测 试剂盒检测目的蛋白的ＳＯＤ活力．利用浓度为０１ｍｍｏｌ／Ｌ百草枯（ＰＱ）压力下生长情况测定表达ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ和 ｈＳＯＤ２蛋白的Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ大肠杆菌的抗氧化能力．结果：测序结果表明４６位密码子已由ＣＡＧ突变为ＡＡＧ．经过 ＩＰＴＧ诱导后野生型和突变体均能表达出大小约为２５ｋＤａ的蛋白．ＳＯＤ活性检测表明ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ突变体的活力 为８９９Ｕ／ｍｇ，比野生型蛋白活性下降了６５．４％．三维结构分析显示，突变点周围氨基酸间氢键被部分打破．结论： 成功构建ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ突变体并成功得到了纯化的突变体蛋白，ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ的 ＳＯＤ活力比野生型降低了 ６５４％，且百草枯压力下表达 ｈＳＯＤ２Ｑ４６Ｋ蛋白的大肠杆菌Ａ 达到０８４，而野生型蛋白的大肠杆菌Ａ 达到 ６００ ６００ １１４．这可能是因为突变点与周围氨基酸间氢键打破，突变点周围失去了原来的稳定结构，底物通道入口处氨基酸 排列疏散，影响电子在氨基酸间的传递，影响静电导向机制，从而阻碍氧自由基在底物通道的通行，使ｈＳＯＤ２的催 化活力下降． ［关键词］　锰超氧化物歧化酶；　表达；　超氧化物歧化酶活性；　突变体 ［中图分类号］　Ｑ７８　　［文献标志码］　Ａ　　［文章编号］　１０００－９９６５（２０１７）０３－０２０５－０９ ｄｏｉ：１０．１１７７８／ｊ．ｊｄｘｂ．２０１７．０３．００４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｍａｎｇａｎｅｓｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ｈＳＯＤ２）Ｑ４６Ｋｍｕｔａｎｔ １ １，２ １