集成微流体驱动泵的微流控微珠阵列芯片用于基因突变检测 - 分析化学.PDF

第4 1 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE )摇 研究报告 第4 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2013 年4 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 473 ~480 藡蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥藡蕥蕥 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.20752 研 究报 告 藡蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥蕥 藡 集成微流体驱动泵的微流控微珠阵列芯片用于 基因突变检测的研究 * 张何 摇 傅 昕摇 朱振军 (湖南工程学院化学化工学院,湘潭4 11104 ) 摘摇 要摇 建立了一种基于微泵集成微流控微珠阵列芯片及三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase )介导的等位基因特 异性延伸的基因突变检测方法。 将微流控芯片、引物修饰微珠阵列及基于毛细和蒸发作用的微流体驱动泵集 成构建检测芯片,待测目标序列流过装配的微球阵列并与微球表面延伸引物杂交,在Apyrase 和去除外切酶 活性的Klenow DNA 聚合酶协同作用下,引物3 忆末端碱基与目标序列包含的基因突变检测位点匹配则能够 发生延伸,并将生物素化的dCTP 掺入到引物的延伸序列中并固定在微球表面,链霉亲和素修饰量子点能与 微球表面引物延伸序列中的生物素结合并提供荧光信号,而引物3 忆末端与目标序列存在单碱基不匹配则不 能发生延伸。 结果表明:采用这种单碱基识别技术,微泵驱动的芯片内可以检测0 .2 pmol/L 目标序列 (信背 比3 ),液压驱动的芯片内能识别0 .5 pmol/L 目标序列,而芯片外检测只能识别0 .1 nmol/L 目标序列,微泵集 成芯片在检测基因突变时其灵敏度较芯片外基因突变分析提高了500 倍,并在0 .5 ~ 30 pmol/L 目标序列浓度 范围内待测序列浓度与检测信号呈良好的线性关系。 测定了一个人基因组样本中多药耐药蛋白基因1 (MDR1)的两个多态性位点C3435T 及G2677T ,结果显示该样本具有3435CT 及2677TT 的基因型组合,此结 果与DNA 测序结果一致。 本方法用于基因突变分析,具有良好的特异性、灵敏性及稳定性。 关键词摇 微泵;微流控微珠阵列;三磷酸腺苷双磷酸酶;基因突变;量子点 1摇 引摇 言 单核苷酸多态性 (Single nucleotide polymorphism,SNP)在1996 年由美国的Lander提出,目前已得 到了广泛的研究和应用[1~3]。 其研究所揭示的人种、人群和个体之间DNA序列的差异以及这些差异所 表现的意义将对疾病的诊断、治疗和预防带来革命性的变化。 目前,用于基因突变的方法主要有等位基因特异性寡核苷酸探针(Allele鄄specific oligonucleotide, [4] [5] ASO) 、等位基因特异性延伸(Allele鄄specific primer extension) 、寡核苷酸连接分析技术(Oligonucle鄄 [6] [7] otide ligation assay) 、等位基因特异性PCR 等,但这些方法在实际应用过程中仍存在一定的局限,如 [8] 其特异性低、成本较高等。 三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)介导的等位基因特异性延伸 是近年发展的 一种高特异性、低成本的高通量SNP检测技术,其特点适合商业化技术的需要。 微流控(Microfluidics)技术是将生物、化学及医学分析过程的样品制备、反应等