新型绿色荧光蛋白突变体的构建和表达.pdfVIP

摘 要 绿色荧光蛋白（GFP ）作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其他酶 类报告蛋白无法比拟的。它是单体蛋白，自发荧光，荧光反应无需外加辅助因子，其 突变体Emerald 不需要紫外激发光，在可见光下肉眼便可以观测到，其荧光性质稳定， 对光漂白有耐受性。在受到强还原剂的影响会丧失荧光，但是将其在放置在有氧气的 环境下，荧光就会恢复。此外，绿色荧光蛋白毒性低，可以直接用于活体细胞的检测。 GFP 是单体蛋白，分子量小，靶蛋白可以融合入在 GFP 的C 端或者N 端，对GFP 的荧光强度的影响都很小。而且，绿色荧光蛋白具有光谱性，其突变体几乎可以在大 多生物中可溶性表达。本文初步研究获得一种新型的超折叠绿色荧光突变体及其循环 突变体，在大肠杆菌中进行重组表达和纯化，并对其突变体进行了光谱学性质分析， 通过在新型的超折叠绿色荧光突变体的上游插入增强序列，与EmGFP 的荧光强度比 较，分析了表达标签对蛋白的表达的影响。获得如下主要结果： 1．定点突变：根据文献报道结果，定点突变祖母绿GFP ，获得六个氨基酸残基 突变的新型绿色荧光蛋白突变体 EsGFP （S30R、Y39N 、N105T、Y145F 、I171V 和 A206V ）。 2 ．位点突变：设计引物，在pET28b 载体上进行TEV 蛋白酶的特异性酶切识别 位点的插入，利于纯化蛋白的组氨酸标签的有效切除。 3. 蛋白重组纯化：构建大肠杆菌新型超折叠绿色荧光蛋白 EsGFP 、循环突变体 CNGFP 的表达载体pET28btev-EsGFP、pET28btev-CNGFP 和带有表达标签的超折叠 绿色荧光蛋白pET28btev-Ex-EsGFP ，Ni-NTA 纯化获得纯度较单一的EsGFP、CNGFP 蛋白，利用TEV 蛋白酶去除His-tag 标签，获得不含组氨酸标签的目的蛋白。 4. 光谱学性质：紫外可见光光谱和荧光光谱分析正装的超折叠绿色荧光蛋白突 变体和倒装的超折叠绿色荧光蛋白循环突变体的谱峰没有发生明显的变化，说明倒装 的超折叠绿色荧光蛋白循环突变体的光谱学性质没有发生明显的变化。带有组氨酸标 签和不带组氨酸标签的蛋白峰值没有发生明显变化，但是峰型发生了明显变化，说明 组氨酸标签对蛋白的晶体生长有一定的影响。 5 ．晶体生长：将纯化的去除组氨酸标签的循环突变体 CNGFP 蛋白超滤至浓度 为10 mg/mL，母液为20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 。采用悬滴法，Hampton Screen III 98 种筛选条件，在10℃恒温生长一周后，显微镜下观察，第74 和84 号条件获得微 晶，其中74 号条件：0.05 mol/L 硫化铯，0.1 mol/L MES ，pH 6.5 ，30%聚醚胺M-600 中晶体生长最优，为柱状晶型。 6. 荧光强度：在EsGFP 基因上游添加表达标签以增强荧光强度，分析了新型超 I 折叠绿色荧光蛋白突变体EsGFP 和加入表达标签的EsGFP （Ex-EsGFP ）在IPTG 诱 导，28 ℃诱导培养后，大肠杆菌重组在可见光和紫外光下显示绿色，荧光值数据分析， EsGFP 的荧光强度比EmGFP 的荧光强度高出8.87%；Ex-EsGFP 的荧光强度比EsGFP 的荧光强度高出18.93%。 综上所述，本研究获得了EsGFP、CNGFP、Ex-EsGFP 的基因，获得新型超折叠 绿色荧光突变体EsGFP （S30R、Y39N 、N105 T、Y145F 、I171V 和A206V ）、循环突 变体CNGFP 和含有表达标签的新型超折叠绿色荧光突变体Ex-EsGFP ，分析了EsGFP 和CNGFP 在大肠杆菌中的重组表达，亲和纯化获得了蛋白，紫外荧光光谱扫描表明 组氨酸标签对晶体生长有一定的影响，对突变体CNGFP 的蛋白进行晶体生长，初步 获得了微晶，荧光强度分析表达标签能促进蛋白的水溶性表达，突变体EsGFP 的荧 光强度强，这为后期蛋白性质的研究奠定了基础。 关键词：定点突变，绿色荧光蛋白，蛋白表达纯化，光谱学性质，晶体生长，表 达标签 II