泛素连接酶Hd1介导神经细胞内过度磷酸化tau蛋白降解.pdfVIP

目 录 英文缩略词表（Abbreviation ）1  中文摘要3  英文摘要7  1 前言13  2 实验材料14  2.1 实验动物14  2.2 细胞株、菌株及质粒15  2.3 抗体15  2.4 主要试剂来源及配制17  2.5 引物及siRNA 18  2.6 实验仪器19  3 实验方法19  3.1 重组质粒的构建及质粒提取19  3.1.1 引物设计和合成19  3.1.2 PCR 扩增20  3.1.3 凝胶回收20  3.1.4 酶切21  3.1.5 连接21  3.1.6 DH5α感受态细胞的制备21  3.1.7 质粒转化22  3.1.8 质粒的小量提取22  3.1.9 重组质粒的鉴定23  3.1.10 质粒的中量提取24  3.2 细胞培养及转染24  3.2.1 肿瘤细胞24  3.2.2 原代胎鼠皮层神经元25  3.3 免疫印迹（Immunoblotting ，IB ）25  3.3.1 蛋白样品制备25  3.3.2 SDS凝胶制备25  3.3.3 上样电泳26  3.3.4 转膜26  3.3.5 IB 检测26  3.4 RT-PCR 26  3.4.1 RNA 提取20  3.4.2 RT 反应27  3.4.3 PCR 扩增27  3.5 免疫共沉淀28  3.6 蛋白质互补实验28  3.7 CHX 示踪实验29  3.8 细胞免疫荧光染色29  3.9 细胞活力测定(MTT) 30  3.10 统计学处理30  4 结果30  4.1 Hrd1 与tau 蛋白之间的相互作用30  4.1.1 免疫共沉淀31  4.1.2 蛋白质片段互补实验31  4.2 Hrd1 降低过度表达的tau 蛋白的水平33  4.3 Hrd1 降低过度磷酸化tau 的水平34  4.4 Hrd1 促进过表达的外源性tau 蛋白的降解34  4.5 Hrd1 促进内源性过度磷酸化tau 蛋白降解35  4.6 Hrd1-siRNA 的设计和验证37  4.7 Hrd1-siRNA 抑制内源性过度磷酸化tau 蛋白的降解38  4.8 Hrd1-siRNA 对细胞活力的影响39  4.9 原代皮层神经元培养及鉴定40  4.10 Hrd1-shRNA 对原代培养的胎鼠皮层神经元的影响41  5 讨论42  6 结论46  7 本研究的创新点47  8 参考文献47  附录51  致 谢53  综述54  英文缩略词表（Abbreviation ） 英文缩写 英文全称 中文全称 AD Alzheimer’s disease 阿尔茨海默病 AP Ammonium persulfate 过硫酸铵 APP Amyloid precursor protein 淀粉样前体蛋白 Aβ β-amyloid β-淀粉样蛋白 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 CHX Cycloheximide 放线菌酮 DAPI