中国医科大学《生物化学》课件-实验七.pptVIP

实验七 底物浓度对酶活性对影响——蔗糖酶米氏常数对测定 Experiment7 Effect of Substrate Concentration on Enzyme Activity ——Michaelis Constant Assay of Sucrose Enzyme 一、目的 1、了解酶促动力学研究的范围 2、以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数Km的原理和方法 二、实验原理 （一）米氏常数的推导 根据Henri的“酶-底物中间复合体”学说，酶促反应中，酶与底物形成中间复合物，再转变成产物，并重新释放出游离的酶。 （二）米氏常数的意义与应用 1. 同一种酶如果有几种底物，就有几个Km，一般用1/ Km表示亲和力的大小，1/ Km越大，表示酶对该底物亲和力越大，酶促反应易于进行。 2. 催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的1/ Km是不同的。测定这些Km值和正逆两向底物的浓度，可大致推知酶在细胞内的主要催化方向和生理意义。 （三）米氏常数的求法 1. 以v对[S]作图 2. 以1/v对1/[S]作图（Lineweaver Burk方程） 3. 以[S]/v对 [S]作图（Hanes 作图法） Lineweaver Burk方程的两侧均乘以[S]，就可以得到如下公式： （三）蔗糖酶米氏常数的测定 水杨酸比色法是1922年由大科利侍戈弗提出，1979年阿·亚·扎戈鲁利科等人对所用试剂的配制比例作了改进，以提高试剂的稳定性和分析的准确度 。 还原糖可将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成氨基，生成氨基化合物。此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在一定波长下（520nm）有最大吸收，吸光度与还原糖含量有线性关系。  (三) 底物浓度对酶促反应速度的影响-米氏常数的测定 取试管7支，按下表所示加入试剂。 四、数据处理 根据各测定管的吸光度值，从标准曲线上，查出相应的还原糖毫克数。 分别计算各反应管相应的[S]、1/[S]、v及1/v， 并分别作出v对[S]曲线图和1/v对1/[S]曲线图。 根据所作的两种动力学曲线图，分别求出酵母蔗糖酶的Km值，并加以比较。 五、注意事项 1. 酶和底物在使用之前，应事先分别预热保温数分钟。 2. 反应时间5min，应尽量准确到秒。 3．温度控制在上下1℃以内。 Effect of substract concentration on enzyme activity----Michaelis constant assay of sucrase Abstract: Objective:To determine Km value of sucrase. Method: Glucose is measured by DNS method. Then, Km value is calculated by the Lineweaver-Burk linerization using the Michaelis-Menten kinetic model. Results: The km value for sucrase at 25℃ and pH4.5 is Conclusion: * 在酶浓度恒定的情况下，当底物浓度很小时，酶未被底物饱和，这时反应速度取决于底物浓度，反应速度与底物浓度呈正比关系，为一级反应。 当底物浓度加大后，酶逐渐被底物饱和，此时介于零级与一级反应； 当底物增加至最大值，所有酶分子被底物饱和，此时接近零级反应，反应速度V也达到了最大值Vmax。 根据中间复合物理论，Michaelis和Menten推导出酶促反应动力学的基本原理，即米氏方程： Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数，V为底物浓度不足以产生Vmax时的反应速度。 3. 当一系列不同的酶催化一个代谢过程连锁反应时，如能确定各种酶的1/ Km及其相应底物的浓度，可推知代谢过程的限速步骤。 4. 了解酶的1/ Km及其底物浓度，也可推知酶在细胞内是否受到底物浓度的调节。 例如酶的Km远低于细胞内底物浓度（低10倍以上） ，则认为酶处于底物饱和状态，底物稍许变化，不会引起反应速度有意义的的改变。 反之，反应速度对底物浓度的变化就十分敏感。 5. 在测定酶活性时，如果要使测得的初速度基本上接近Vmax时，而过量的底物又不至于抑制酶活性时，一般[S]值需为Km 值10倍以上。 由米氏方程可知，当酶促反应处于V=1/2Vmax时，Km=[S]，也即米氏常数Km为酶促反应速度达到最大反应速率一半时的底物浓度。 因此可以测定一系列